(常用分子标记技术原理及应用.ppt

 知识框架 什么是遗传标记（Genetic Marker）? 遗传标记指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。 遗传标记的类型主要有四大类： 1.形态标记 ( morphological marker ) 2.细胞学标记( cytological marker ) 3.生化标记 ( biochemical marker ) 4.分子标记 ( molecular marker ) 形态标记（Morphological marker） 生化标记（Biochemical Marker） 概念：主要包括贮藏蛋白、同工酶等标记，也指以基因表达的蛋白质产物为主的一类遗传标记系统。 种类：可分为酶蛋白质和非酶蛋白质两类。在非酶蛋白质中用得最多的是种子贮藏蛋白（清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白）。 同工酶（isoenzyes)：催化功能相同，但结构和生理性质不同的一类酶。 生化标记的优点：数量更丰富，受环境影响更小。 生化标记的缺点：蛋白质受生物体发育的时空影响很大。 分子标记来源于DNA水平的突变 突变(Mutation)：是指DNA水平的可遗传的变异，不管这种DNA变异能不能导致可检测的表型或生化改变。突变产生的变异是自然选择的基础。可遗传的突变在群体中扩散从而产生多态性。 多态性(Polymorphism)：－群体内同一DNA序列的两种或多种变异形式，统计表明：群体内任何两个生物个体平均每1000～10000个碱基对有一对有差别，这种差别就是多态性。 一. 分子标记相关概念 1.广义的分子标记(molecular marker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。 eg:蛋白质标记如种子贮藏蛋白同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式） 2.狭义的分子标记（DNA marker)概念只是指DNA标记 能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。  AFLP—扩增片段长度多态性标记( Amplified Fragment Length Polymorphism ) 起源：1992年由荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法。 定义:由于单核甘酸突变或插入及缺失突变导致增加或减少限制性酶切位点，这种差异可通过选择性的PCR扩增而检测。AFLP是在RFLP的基础上发展起来的，差别在于检测手段。 核心技术：AFLP的关键是设计选择性扩增引物以及不同引物组合。 AFLP的原理Principle of AFLP 基本原理：对基因组DNA用两种限制性内切酶进行消化，连上相应的双链人工接头，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，并在3’端添加1-2个随机碱基对酶切连接后的DNA进行选择性扩增。此后再进行第二次PCR扩增，所用的引物是在第一次PCR中使用的选择性引物的3’端又附加了1-3个随机碱基。扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶检测，银染显色。 多态性源自限制性酶切位点的变异。 AFLP的实验操作Procedures for AFLP AFLP技术主要包括模板DNA制备、引物设计、酶切片段扩增及凝胶电泳分析4个步骤。各步骤具体的过程有：1.DNA模板酶切和接头连接（EcoRI/MseI）2.在Taq聚合酶的作用下，完成AFLP的选择性扩增。?3.PCR产物变性后在含尿素的聚丙烯酰胺变性胶上电泳。4.多态性比较分析，特异片段回收克隆分析。 AFLP技术路线 1.基因组DNA被酶切成小片段：通常用一个四个碱基识别位点的限制性内切酶如MseI和一个六个碱基识别位点的酶如EcoRI，其中MseI确保产生合适大小的DNA片段，这些片段能在序列胶上进行有效的分离；而六碱基识别位点酶EcoRI能够限制扩增片段数目，确保DNA多态性的正常检测； 2.接头与酶切片段的连接：接头序列包括：一个核心序列和酶切位点特异序列，MSE接头和ECORI接头，核心序列是一段已知的20核甘酸的DNA序列； 3.预扩增：应用一对引物对酶切片段进行第一轮扩增，目的是富聚目标片段，减少本底，扩增引物序列为接头序列加一个选择核甘酸。只有一端为EcoRI切点，一端为MseI切点的DNA酶切片段，同时也与选择核甘酸配对的DNA序列才能被扩增。1～3步的产物可以通过Agarose胶检测。 4.选择扩增：应用含有接头序列和三个选择核甘酸序列的引