WRKY的克隆探究.doc

LeWRKY1的克隆 学生姓名：陈思佳 导师姓名：孙清鹏 张 卿 摘要 WRKY基因的命名是根据其所编码的转录调控因子WRKY蛋白至少还有60个氨基酸的高度保守结构域，几乎所有成员在此结构的N-端都有WRKYGQK这样的7肽，因此简称为WRKY。本实验是从保存的含有WRKY基因的大肠杆菌中提取含有WRKY基因的质粒，通过质粒重组构建以Pri101-AN为载体的重组质粒，转入大肠杆菌中，然后转入农杆菌中。 关键词 WRKY基因；转录因子；基因克隆 WRKY the clones Name of student:ChenSijia Name of tutor:Sun Qingpeng Abstract Of WRKY genes named according to their encoded transcription factors WRKY proteins,there are at least 60 amino acids highly conserved domain,almost all members of the N-terminus in this structure has WRKYGQK 7 peptide,and therefore referred to as of WRKY.This experiment is saved with WRKY genes in E.coli extract containing WRKY genes,plasmids,and recombinant plasmid construct recombinant plasmid was transformed into E.coli in to Pri101-AN-carrier,and then transformed into Agrobacterium. Key words WRKY genes;transcription factor;gene cloning 目 录 1 WRKY的概况 3 1.1 WRKY基因的命名、结构、分类 3 1.2 W盒 4 1.3 WRKY的发现及其演化 4 1.4 WRKY转录因子功能的多样性 5 1.4.1在生物胁迫中的作用 5 1.4.2在非生物胁迫中的作用 6 1.4.3 WRKY转录因子在植物生长发育中的调节作用 6 2 pRI-101-DNA载体 6 3 材料、试剂及仪器 7 3.1材料 7 3.2 培养基 7 3.2.1 YEB培养基 7 3.2.2 LB培养基 7 3.2.3 10×TBE Buffer 7 3.3主要仪器和设备 8 4实验方法及结果 8 4.1大肠杆菌感受态细胞的制备 8 4.2 农杆菌感受态细胞的制备 8 4.3重组质粒的建立 8 4.3.1 提取含LeWRKY1质粒 9 4.3.2提取载体pRI101-AN质粒 9 4.3.3 目的片段的回收 9 4.3.4建立重组质粒 10 4.3.4.1建立连接体系 10 4.4将重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态中 10 4.5转基因大肠杆菌的扩大培养 11 4.6重组质粒的鉴定 11 4.7重组质粒转化 11 4.8扩大培养 11 4.9质粒鉴定 11 5 结果与讨论 11 6 参考文献: 14 7致谢 17 1 WRKY的概况 植物在其长期一系列的生长发育过程中，经常会遇到生物或非生物的胁迫，而逐渐形成对恶劣环境（如病原菌、干旱、寒冷等）这些生物或非生物的胁迫作出一种积极主动反应。这种胁迫可以从调节基因表达和细胞代谢到生长速率和产量变化等引发植物产生一些列应对反应。在抵御外界生物和非生物胁迫的逆境条件下，植物基因组中有部分参与对环境变化的信号参与对环境变化的信号转导或转录调控的基因。 近年来被发现植物中特有的一类转录因子家族——WRKY家族，WRKY转录因子参与了植物免疫反应在对逆境的防卫反应中起到了重要的调节作用。 转录因子在基因表达的调控过程中发挥着重要作用，转录因子有称作反式作用因子，它具有特意为点的识别与结合活性，能与真核基因启动子区域中顺式作用元件发生特异性相互作用激活或抑制基因转录效应的一类DNA结合蛋白。其与靶基因上游的各种特定DNA元件结合，激活或抑制靶基因相对应的转录活性，以调控其特异性表达[1]，最终使得植物能够对外界逆境信号迅速做出正确的抵御反应。 1.1 WRKY基因的命名、结构、分类 WRKY转录因子是一个超家族蛋白，因其各个成员的DNA结合区域都至少含有1个大约由60个氨基酸组成的高度保守WRKY结构域这个最显著的结构特点而被命名。WRKY结构域的核心序列是位于N端β折叠片包含7个绝对保守的氨基酸残基WRKYGQK，该结构域的