microRNA(miRNA)茎环法引物设计及过程原理说明学案.doc

microRNA（miRNA）引物设计及过程原理说明 microRNAs的平均长度23nt左右，所以miRNA引物设计与常规引物设计存在很大差别，以下讲解一下整个miRNA引物设计的过程加上实验流程，以帮助大家对各方面的学习。 首先，引物设计之前先介绍miRNA反转录合成cDNA的过程。 我们拿经典颈环序列GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC作介绍。打开DNAstar软件的PrimerSelect；file打开下拉菜单；打开Enter New Primer…；粘贴颈环序列；点击OK。 颈环结构已经输入，下面查看颈环结构回形成的那些发夹结构。 选择颈环结构（鼠标点一下）；点击Report下拉菜单；选择Primer Hairpins。 第一个发夹结构是实验所需的结构(dG=-20.4kc/m)。 下面结合has-miR-122-5P合成cDNA的具体过程讲解has-miR-122-5P：UGGAGUGUGACAAUGGUGUUUGU 将U转T，方便后面使用：TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGT miRNAs的颈环结构引物：是将miRNAs的3’端后6位碱基反向互补添加到经典颈环结构的3’端形成的结构。(自己根据后面图片想一下原因，加6个碱基为经验所授) has-miR-122-5P的后6位：GTTTGT has-miR-122-5P的后6位的反向互补序列：ACAAAC 颈环引物序列： 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAC -3’ 查看形成的发夹结构（方法前面有讲） 看一下miRNA和颈环引物在一起会是怎么样子： 在含反转录酶及适当的条件下，miRNA和其颈环引物将会合成cDNA链：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAACACCATTGTCACACTCCA 查看cDNA结构： 我们知道了cDNA的合成过程和序列，同时学习了miRNA的反转录过程。 下面进入重头戏，教大家如何进行miRNA引物设计。首先如果你的前面实验是芯片的就在miRbase上再查看核对一遍，如果是测序实验的需要将miRNA的名字3p或5p及之前的部分复制到miRAN上查找完整序列。将得到的miRNA完整序列复制到一个excel表中，然后使用查找替换将U改为T（一定要记住改换，要不然primer5.0是不认U的）。 为了后面引物设计方便，需要以miRNA序列构建引物，所以需要将miRNA的cDNA的反向互补序列找出。使用primer5.0。 打开File下拉菜单；New；DNA Sequence。 由于正规设计过程中不会先把cDNA序列找出来，所以直接操作过程为先将miRNA序列（U改T）输入，再输入颈环结构序列的反向互补序列。 复制miRNA序列（U改T）；点击primer5.0序列框，使用组合键“Ctrl+V”粘贴序列；选择正向序列。 复制颈环结构序列；点击primer5.0序列框，使用组合键“Ctrl+V”粘贴序列；选择反向互补序列输入Reverse Complemented。 到这一歩cDNA的反向互补序列已经输入完毕，下一歩是在primer5.0上进行引物设计。 在序列前面输入9个N（这个是个人习惯，也有人是6个或以上的A，也有人是不输入就直接设计引物的），因为miRNA序列太短，很多时候不能设计出符合实验需要的miRNA，所以在设计正向引物时，一般需要加入3-6个碱基，最多时加入8个碱基，以满足正向引物的设计； 点击Function框下的Primer，开始设计上下游引物； 有经典颈环结构自然也就少不了常用的下游引物，一般使用CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT;CGCAGGGTCCGAGGTATTC。同时还可以适当的在颈环序列中前后移动碱基设计下游引物； 自动跳出的显示框中默认选择的是下游引物，正好符合先将常用下游引物输入的操作。下游引物相当比较固定，先输入下游引物对整个引物设计能够提高设计效率。 点击框内的Edit Primers；选择所有引物序列；使用组合键“Ctrl+V”输入下游引物，输入方式为反向输入Reversed；点击OK； 点击Analyze分析引物基本信息；点击Prime寻找引物在序列里结合部位；点击OK确定下游引物； 点击上下游转换键（图示），开始设计上游引物；点击Edit Primers； 去除前面的9个N；点击Analyze；点击prime；查看前面不添加序列时的上游引物状况如何。 在这里的主要问题是Tm值太低，第二个问题是长度稍短。 绝大多数情况下在前边添加的序列已GC为主，且在加GC序列时如果序列中间不以AT隔开则TM值上升比值高，同理