在花青素生物合成调控机制中土豆StAN11Gene的克隆和特征.doc

在花青素生物合成调控机制中土豆StAN11 蛋白 基因的克隆和特征 摘要：花青素是植物次生代谢的一类产物，决定着土豆块茎的颜色，花青素的生物合成是一个复杂的生物过程，涉及了大量的基因，包括结构基因和调控基因，在此次研究中，从Chieftain土豆品种中克隆来的一个WD40重复蛋白基因StAN11,。StAN11 (HQ599506) 不包括内含子，开放阅读框为1029bp，编码342个AA的蛋白质，为了查证它在花青素合成中的作用，StAN11被导入CaMV‐35S启动子的pCMBIA1304后面，然后再合成的载体利用农杆菌转化法被引入到 Désiré品种中，与野生品种的空白对照相比，转基因块茎的颜色大大的加深了，这这种颜色的加深与花青素的积累和StAN11 的表达保持着高度的一致。进一步对转基因植物黄铜-3-羟化酶，二氢黄酮醇还原酶(DFR),花青素合酶（ANS）,类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶的表达进行分析，发现了只有DFR是增高的，这说明StAN11是通过控制DFR的表达来调控花青素的合成的，以花青素生物合成作为遗传背景，块茎中StAN11的过表达和可以提高花青素的积累。 关键词： 花青素生物合成，克隆基因转录，土豆，StAN11 引言 花青素是从植物中提取的黄酮类色素，决定着植物的颜色，在植物抵抗非生物和生物逆境中起作用，吸引昆虫授粉，提高种子的传播效率，它的高抗氧化性常常用于抗癌变，抗诱变，抗菌，抗炎症，抗动脉粥样硬化。 由结构基因编码的大量酶对花青素的生物合成起重要作用，已经发现的有三种转录调节因子在花青素的合成中，分别是 R2R3‐MYB, basic helix‐loop‐helix (bHLH), and WD40‐repeat (WDR)proteins，这些转录蛋白的结合和相互作用决定这下游基因的表达，在拟南芥中，花青素的生物合成主要是通过三元配合物活化DFR和LDOX(无色花青素双加氧酶)结构基因来调节，蓝光诱导花青素的积累，在拟南芥种子发育中茉莉酮酸酯也由 WD‐repeat/Myb/bHLH 转录复合物来调节，在土豆中，MYB转录因子 StMtf1 和StAN2很好的被分离出来了，并且证明了它们在花青素的生物合成中起调控作用。 近些年与花青素合成有关的WD40‐repeat 转录因子在拟南芥玉米，矮牵牛花，金鱼草中很好的表达出来了，并且包含了一个特殊的高度保守的 try‐asp（WD）‐repeat ，但是没有固定的酶和转录因子的活性.在拟南芥中，TTG1编码的WD40‐repeat蛋白被证实涉及MBW复合体的结构和稳定性，在突变体ttg1缺乏花青素的时候MBW复合体控制着花青素的合成和表皮毛和根毛的结构。这个基因的同源染色体已经在其他植物中被鉴定了， 矮牵牛花杂种的AN11 ，玉米的PAC1 ,紫罗兰的MtWD40‐1 。 WDR可以提高bHLH 在紫麻 Perilla frutescens中的核定位，可能与MYB的翻译后调控有关，液泡PH的控制，and 种皮表皮的形态学特征在P. Hybrid中，大多数分离的WD‐repeat的蛋白在花青素的合成中是必须的。 彩色土豆包含大量的花青素，并且是公认的有利于人身体健康的抗氧化剂的重要的来源，随着花青素高含量土豆价值的增加和生物技术的发展，代谢工程学通过过表达调节基因来获得新的土豆品种是一个广泛应用的方法， Jung的研究说明了在土豆中过表达调节了 StAN2基因，可以提高土豆块茎中花青素的含量，编码 WD40重复蛋白的基因AN11，第一次是在矮牵牛花杂种中发现的，但是并没有在土豆中报道过。在这篇报道中 StAN11从土豆变种Chieftain中分理出来，它的作用通过土豆变种Désirée中基因过表达来分析。 结论 StAN11是与花青素合成途径有关的调节基因的同系物 StAN11 的全部CDNA是利用一对特殊引物通过基因的折叠来获得的，两个 1,100bp的片段分别是由土豆cDNA和基因组DNA扩展来的,这些序列被存放在 GenBank。 StAN11包括1029bp的开放阅读框，编码342个AA，分子质量为32KDa,等电点为4.95，通过对cDNA和DNA的比较发现StAN11没有内含子， 通过将StAN11蛋白质序列与来自GenBank和EMBL数据库的植物的序列相比发现它有一段重要的序列与NcWDR(93.86%),PhAN11 (88.63%), MdTTG1 (83.33%), and VvWD40 (80.70%)相似(Figure 1A)。这些基因都参与了花青素合成。对 StAN11 protein 保守序列的分析发现它包括4中WD‐repeat基序(theAA residuesare at 67–112, 117–162, 16