冬凌草甲素对膀胱癌T24细胞增殖的抑制作用.docVIP

冬凌草甲素对膀胱癌T24细胞增殖的抑制作用 　　[摘要] 目的 探讨不同浓度的冬凌草甲素（ORI）在不同时间点对膀胱癌T24细胞增殖的抑制作用，为临床决策提供参考依据。 方法 将冬凌草甲素作用于T24细胞，利用酶标仪在不同时间点（λ=570 nm）测定不同浓度的冬凌草甲素吸光度，同样方式用MTT法检测细胞的抑制率，流式细胞仪测定细胞凋亡率，其数值均以均数±标准差表示，每组结果由两位研究者重复测量2次校对。 结果 随着培养时间的延长及浓度的增加，T24细胞的吸光度数值呈明显下降趋势，差异有统计学意义（P 0.05）。浓度为8 μmol/L时抑制率递增，16 μmol/L时抑制率已接近50%，而32 μmol/L时抑制率最高可达70%以上，变化显著，差异有统计学意义（P 0.05）。随时间、浓度梯度的变化，T24细胞凋亡率不断增加，最高可达60%以上，差异有统计学意义（P 0.05）。证明冬凌草甲素对膀胱癌T24细胞增殖的抑制具有明显的浓度-效应与时间-效应的关系。 结论 冬凌草甲素可诱导膀胱癌T24细胞凋亡，有明显的抗肿瘤作用。 　　[关键词] 冬凌草甲素；T24细胞；吸光度；抑制；凋亡 　　[中图分类号] R737 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）05（b）-0004-03 　　冬凌草又称为冰凌草、雪花草，因形似蝶状冰凌片而得名，在冬凌草植被中提炼出的一种二萜类抗肿瘤天然有机化合物成分为冬凌草甲素（ORI）。近年来有大量文献曾研究冬凌草具有抗肿瘤作用[1-2]，常用于食管癌、胃癌的治疗，其无明显毒副作用，效果较好[3]。临床研究中曾报道，冬凌草有明显的抑制膀胱肿瘤的作用[4]，车宪平等[5]也曾研究过预防小鼠膀胱癌的复发，具体作用机制尚不明确。基于此，本次实验试探讨ORI对膀胱癌T24细胞增殖的抑制作用及机制。 　　1 资料与方法 　　1.1 细胞及试剂 　　冬凌草甲素（上海双博生物科技有限公司111721-200602），二甲基亚砜（DMSO， BIOSHARP公司0231），T24细胞（上海瑞齐生物科技有限公司RS20230），1640培养液（北京赛默飞世尔生物公司SH30809），小牛血清（杭州四季青公司121005），磷酸盐缓冲液（PBS， solarbio公司P1022-500），四甲基噻唑蓝（MTT，sigma M-2122），Avnnexin V-FITC试剂盒（碧云天生物科技有限公司C1062），Hoechst 33258（Sigma公。 　　1.2 仪器及设备 　　超净工作台（苏净集团安泰公司），二氧化碳细胞培养箱（上海力申科学仪器有限公司），酶标仪（美国贝克曼公司），电子、倒置显微镜（奥林巴斯电子公司），流式细胞仪及配套鞘液（美国贝克曼公司），离心机（德国RUMA-ZENTRIFUGEN），-80℃冰箱及4℃冰箱（日本SANYO公司），96孔培养板（上海乔跃电子有限公司），电热恒温水浴箱（上海博迅实业有限公司）。 　　1.3 操作方法 　　细胞培养：将T24细胞放置于含有10%小牛血清的RPMI-1640培养液中，37℃二氧化碳培养箱里培养，每1天换液1次，收集对数生长期的细胞进行实验。 　　细胞吸光度的测定：2.5 mmol/LDMSO加入含有冬凌草甲素的培养瓶中，分别添加10 μL、20 μL、40 μL，将其冬凌草甲素的浓度调制为8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L；以相同浓度的PBS溶液加入到培养瓶中作为对照组，用酶标仪（λ=570 nm为测试波长，λ=630 nm为参考波长）读取吸光度A值。 　　细胞抑制率的测定：取对数增长期的T24细胞，调整细胞浓度为2×105/mL，接种于96孔板上，每孔加入细胞悬液100 μL，培养10 h后分别加入8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L浓度的冬凌草甲素，以加入相同浓度的PBS溶液作为对照，培养48 h后，分别加入5 g/LMTT溶液20 μL，再培养4 h后取出，离心去上清液，再分别加入PBS溶液150 μL振荡摇匀，显微镜下观察其着色粒消失后以λ=570 nm测试波长，λ=630 nm为参考波长读取吸光度A值，并通过吸光度值计算细胞抑制率（Apbs-Aori）/Apbs，其中Apbs为磷酸盐缓冲液的吸光度值，Aori为冬凌草甲素的吸光度值。 　　细胞凋亡率的测定：根据Avnnexin V-FITC试剂盒说明操作，将三个浓度为8 μmol/L、16 μmol/L、32 μmol/L的冬凌草甲素分别加入到不同时间点的T24培养瓶里（悬浮在500 μL缓冲液中），并各自加入5 uL Avnnexin V-FITC，避光放置5 mi