分化和DNA结合抑制因子1基因对MDA—MB—231乳腺癌细胞株MMP9表达的影响.docVIP

分化和DNA结合抑制因子1基因对MDA—MB—231乳腺癌细胞株MMP9表达的影响 　　【摘要】目的筛选成功转染Id1miRNA真核表达载体乳腺癌MDA-MB-231细胞系，观察对乳腺癌细胞的对Id1、MMP9表达的影响。方法构建Id1miRNA真核表达载体，转染乳腺癌MDA-MB-231细胞株以杀稻瘟霉素筛选稳定表达的细胞株。经RT-PCR方法鉴定其对Id1、MMP9表达的影响。结果经过筛选，获得转染Id1miRNA真核表达载体稳定表达的MDA-MB-231细胞系。经RT-PCR方法鉴定，结果表明转染Id1miRNA真核表达载体的乳腺癌MDA-MB-231细胞株其Id1、MMP9表达水平低于对照组，且Id1、MMP9表达水平正相关。未转染组与阴性对照转染组无明显差异。结论本实验成功筛选出稳定表达Id1miRNA的乳腺癌细胞株，证实Id1miRNA真核表达载体构建成功干扰有效，并且Id1与mmp9表达相关，为将来进一步研究他们之间的生物学行为差异，或详细了解其分子作用机制奠定了基础。 　　【关键词】 　　Id1；MMP9；真核表达载体；乳腺癌细胞株 　　Id1（InhibitionofDNAbinding/differentiation）蛋白是一组缺乏碱性DNA连接结构域的HLH因子。被认为是分化和DNA结合的抑制剂。研究发现Id家族的蛋白在许多肿瘤中的表达是上调的[1-4]，研究证实其参与肿瘤的发生，与肿瘤细胞的恶性转化、生长、浸润、转移相关[4]。本实验室曾报道Id1与细胞增殖及血管内皮生长因子表达的关系[5]。本研究旨在探讨Id1基因与MMP9表达的关系，初步探讨Id1影响乳腺癌恶性生物学行为的机制。 　　1资料与方法 　　乳腺癌细胞MDA-MB-232细胞株。大观霉素。Sc734-Id1单抗（兔源），MMP9单抗（兔源）。lipofectamine2000脂质体转染试剂盒。杀稻瘟霉素。RT试剂盒A3500。Id1miRNA干扰序列及阴性对照序列，质粒等[6]。 　　1.1乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞的培养与传代确定杀稻瘟霉素筛选浓度为：6ng/L。 　　1.2以Lipofectamine2000及各重组质粒分别转染乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞株及以6ng/L杀稻瘟霉素稳定转染细胞株的筛选[6]。 　　1.3RT-PCR法检测Id1MMP9mRNA表达。 　　1.4免疫细胞化学方法检测Id1蛋白、MMP9蛋白表达：以MMP9（1∶100）和Id1（1∶300）单克隆抗体检测、对比转染前后MDA-MB-231细胞株中MMP9及Id1蛋白表达。 　　2结果 　　2.2实验结果证实转染重组质粒Id1-pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR真核表达载体的细胞C组克隆中MMP9表达水平降低；整合negativecontrol阴性对照载体的细胞克隆B组中Id1RNA的表达水平与无转染A组相似。 　　3讨论 　　乳腺癌的浸润，转移是导致许多女性死亡的重要原因。Id1过度表达与乳腺癌发生、发展、浸润、转移关系密切。Id1蛋白可以通过多条途径影响CyclinD1的表达，推动细胞周期由G1期进入S期，通过MAPK途径促使下游早期生长反应基因转录和翻译的增加，促进细胞增殖[7]。致细胞侵袭性和迁移性增加，使其通过基底膜的侵袭力大大提高，Id1可能通过影响乳腺组织基质金属蛋白酶（MMP），促进乳腺癌细胞的侵袭、转移等。[8] 　　MMP9是基质金属蛋白酶家族一员。参与肿瘤转移等病理过程。通过对肿瘤浸润和转移的机制研究发现细胞外基质（ECM）在肿瘤的的浸润和转移过程中起着关键的作用[9]。肿瘤细胞侵袭、转移能力与其诱导产生降解ECM、基底膜的蛋白酶的能力密切相关，肿瘤细胞分泌的基质金属蛋白酶能够降解ECM，从而促进肿瘤的浸润和转移[10]。 　　本研究通过构建miRNA真核表达载体，转染MDA-MB-231乳腺癌细胞株，成功抑制Id1基因表达。研究同时发现其也可以抑制MMP9的高表达，提示Id1与MMP9之间存在一定的内在联系，MMP9可能是Id1作用通路中的下游因子，其功能的实现可能受到Id1的调节。Id1可能通过影响MMP9表达促进肿瘤细胞分泌基质金属蛋白酶降解细胞外基质，促进肿瘤的浸润和转移。另肿瘤的发生，发展及侵袭过程必然伴随着新生血管的生成，VEGF被认为是最主要，最特异性的一种内皮细胞生长因子。本实验室既往研究证实Id1与乳腺癌增殖及血管生成的行为有关[5]。综合提示Id1可能通过调节MMP9、VEGF等下游因子推动细胞周期参与肿瘤的发生，发展，侵袭，转移过程。 　　综上所述，Id1基因与乳腺癌细胞增殖、侵袭、转移等生物学行为存在密切的关系，这可能是导致乳腺癌预后不良的生物学