参芎明胶微球对小鼠肺组织TGFβ的干预研究.docVIP

参芎明胶微球对小鼠肺组织TGFβ的干预研究 　　【摘要】 目的：通过成功复制小鼠肺纤维化模型，探讨肺靶向参芎明胶微球对肺间质纤维化的影响，从而找到解决肺纤维化的有效治疗方法。方法：选取60只健康小鼠，随机分为三组，正常对照组、参芎明胶微球药物治疗组、模型组各20只。通过病理观察判断模型成功与否，以及测定肺组织转化生长因子β（Transforming growth factorβ， TGFβ）积分光密度值（IOD），来确定参芎明胶微球治疗干预肺纤维化的疗效。结果：模型组肺组织TGFβ1 IOD值明显高于参芎明胶微球药物治疗组，比较差异有统计学意义（P0.01）。结论：参芎明胶微球可降低肺纤维化小鼠早期TGFβ1在肺组织的表达，对小鼠肺纤维化有一定的抑制作用。 　　【关键词】 参芎明胶微球； 肺间质纤维化； 转化生长因子β 　　丹参为唇形科多年生草本植物丹参的根及根茎，具有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦，有减轻心肌、脑缺血再灌注损伤，抑制血小板凝聚和血栓形成，抑制胶原纤维的产生和促进纤维蛋白降解，清除自由基等药理作用。川芎为伞形科蒿木属植物的根茎，功能为活血行气，消散淤血，祛风止痛。 　　间质性肺纤维化（interstitial lung disease， ILD）是一组主要累及肺间质、肺泡和（或）细支气管的肺部弥漫性疾病，通常亦称作弥漫性实质性肺疾病（DPLD）[1]。丹参、川芎是非常有使用前景的抗纤维化药物，本实验采用现代靶向制剂技术，以生物降解型高分子材料明胶为载体制成肺靶向参芎明胶微球，控制粒径在7～30 μm范围内，经静脉注射给药，使参芎明胶微球最大限度靶向浓集于肺组织，提高肺部病变部位药物浓度，有利于其发挥药理作用。TGFβ具有多种生物学效应，其来源于肺巨噬细胞和上皮细胞，可刺激未成熟成纤维细胞的生长，对成纤维细胞具有趋化作用[2]，以加速肺纤维化发展。TGFβ在哺乳类动物中共有三种异构体，即TGFβ1、TGFβ2、TGFβ3，其中TGFβ1分布最广，研究得也最多。体外研究表明，TGFβ1可刺激肺成纤维细胞合成大量胶原[2]。目前参芎明胶微球制剂对TGFβ1的干预研究尚未见报道，笔者为开发此药提供部分实验基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料与仪器 丹参素钠（标准品）、盐酸川芎嗪（标准品）购自大连美仑生物技术有限公司；兔多克隆抗体TGFβ1即用型SABC试剂盒，DAB显色剂（武汉博士德生物工程有限公司）。722型分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司生产。 　　1.2 实验动物 选取60只健康小鼠，雌雄各半，随机分为三组，正常对照组、参芎明胶微球药物治疗组、模型组。每组20只。 　　1.3 参芎明胶微球制备 称取丹参素钠、盐酸川芎嗪各0.5 g，明胶6 g，将明胶加入到60 ml蒸馏水中，置60 ℃水浴上完全溶解，将丹参素钠、盐酸川芎嗪缓慢加入到上述溶液中，充分搅拌形成水相；然后加入到含有span-80 7.2 ml，液体石蜡360 ml的油相中，滴加时油相保持在（60±1）℃，乳化15 min，控制转速750 r/min。迅速放入冰水浴中，降至5 ℃以下，加入甲醛60 ml，搅拌下固化1 h，然后加入120 ml异丙醇脱水1 h，用丙酮和石油醚交替洗涤3次，抽滤，真空干燥24 h，即得棕黄色粉末状微球。光学显微镜显示：微球呈球形，表面光滑，粒径分布较窄、分散性好，不粘连或极少粘连，流动性好。 　　1.4 造模 实验小鼠用4%水合氯醛（0.01 ml/g）腹腔注射麻醉后，取仰卧固定位，常规消毒，行颈正中切口，钝性分离暴露气管，模型组、参芎明胶微球药物治疗组小鼠于气管软骨环间隙穿刺缓缓注入博莱霉素（5 mg/kg）[3]，正常对照组注入等体积生理盐水。 　　1.5 给药方法 参芎明胶微球药物治疗组于造模后次日开始灌服给药40 mg/（kg·d），正常对照组与模型组灌服蒸馏水。 　　1.6 检测指标与方法 将小鼠处死后，取出两肺。应用免疫组织化学技术，检测TGFβ1在肺组织的表达。采用PAS9000 病理图像分析系统，用积分光密度（IOD）来衡量肺组织中TGF-β1的含量。每张切片选取5个高倍视野（×400），以巨噬细胞胞浆染为棕色、棕黄色、褐色为阳性细胞，计数阳性细胞数/高倍视野[4]，进行定量分析，根据免疫组化阳性着色的深浅计算每个视野的IOD[5]，求平均值。 　　1.7 病理观察 肺组织用10%甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，按四级分类法评价肺脏病变程度，进行常规病理学检查[1]。 　　1.8 统计学处理 使用PEMS 3.1统计学软件进行分析，计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t检验，P0.05为差异有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 不同时间小鼠肺组织TGF