外周血miR—29a—3p、miR—365a—3p在活动性肺结核和结核潜伏感染者中的表达.docVIP

外周血miR—29a—3p、miR—365a—3p在活动性肺结核和结核潜伏感染者中的表达 　　[摘要] 目的 探讨外周血miR-29a-3p、miR-365a-3p在活动性肺结核和结核潜伏感染者中的差异表达。 方法 收集深圳市南山区慢性病防治院结核病防治科门诊2012年1～10月诊治的活动性肺结核患者30例，及同期发现的结核潜伏感染者30例。采集全血，提取总RNA，利用定量PCR方法检测外周血miR-29a-3p、miR-365a-3p的表达。 结果 结核潜伏感染者外周血中miR-29a-3p（1.16±0.65）明显高于活动性肺结核患者的表达（0.71±0.32），差异有统计学意义（P 0.05）；进一步分析发现，结核潜伏感染者外周血miR-29a-3p表达与结核菌特异性酶联免疫斑点数呈负相关（r = -0.42，P = 0.02）。 结论 miR-29a-3p在肺结核感染、发病中可能起到重要作用，可能成为诊断结核潜伏感染者的标志物。 　　[关键词] 肺结核；结核潜伏感染者；微小RNA 　　[中图分类号] R521 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）08（a）-0036-03 　　微小RNA（microRNA，miRNA）是一类广泛存在于真核细胞中，长度约20 nt的高度保守的非编码RNA调控因子，是由全长的mRNA 样转录子加工而来，通过与对应的靶mRNA的3非翻译区的非完全或完全配对结合，阻止其翻译或破坏其稳定性，实现对基因表达的调控，越来越多的研究表明，miRNA在肿瘤、糖尿病、心血管疾病、病毒感染等多种疾病中都起着重要作用，是正常和疾病状态下基因调节的一个新的机制[1-2]。近年miRNA在肺结核患者中表达也是研究热点之一。本研究主要探讨miR-29a-3p、miR-365a-3p分子在活动性肺结核（TB）和结核潜伏感染（LTBI）者外周血中的表达情况。 　　1 资料与方法 　　1.1 一般资料 　　收集深圳市南山区慢性病防治院（以下简称“我院”）结核病防治科门诊2012年1～10月诊治的TB患者30例，其中男17例，女13例，平均年龄（26.1±10.1）岁，诊断标准：经痰抗酸杆菌涂片阳性，临床症状结合X线表现、CT诊断以及病原学检查，符合全国结核病分类与诊断标准；LTBI者30例，其中男14例，女16例，平均年龄（28.9±9.5）岁，判定标准：采用结核菌特异性酶联免疫斑点试验阳性，而胸片未见异常[3]。两组研究对象之间的年龄、性别比较差异无统计学意义（P 0.05）。所有研究对象均排除HBV、HCV、HIV病毒感染及其他慢性疾病如高血压、糖尿病、肾炎、自身免疫性疾病等。所有研究对象均经我院伦理委员会批准通过，并签署知情同意书。 　　1.2 标本的收集和处理 　　抽取外周静脉血2 mL，30 min内分装200 μL全血于冻存管中（已预装有Trizol和研磨珠），振荡混匀后-80℃保存；根据Trizol Reagent试剂盒说明书（Invitrogen）抽提总RNA，核酸测定仪测定浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳分析RNA的完整性；-80℃保存。 　　1.3 研究方法 　　1.3.1 全血RNA提取 加入1 mL Trizol，充分裂解细胞，加入200 μL氯仿，剧烈振荡15 s，室温放置3 min，12 000 r/min，4℃，离心15 min。吸取上层水相，至另一离心管中。加入1.5倍体积异丙醇充分混匀，室温放置10 min。12 000 r/min，4℃，离心10 min，RNA沉淀于管底，倾倒上清，沉淀物用75%乙醇洗涤2次，室温晾干10 min，加入适量无RNase水充分溶解，调整RNA浓度。 　　1.3.2 反转录-荧光定量PCR检测 miRNA反转录反应体系为20 μL，0.5 g/L总RNA 1 μL，2×反转录缓冲混合物10 μL，RNase Free水5 μL，反转录酶2 μL，0.1% BSA 2 μL。反转录反应条件为37℃ 60 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。荧光定量PCR反应体系为25 μL，cDNA模板2 μL，水8.5 μL，SYBR Green 12.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL。荧光定量PCR反应条件为预变性95℃ 10 s；变性和延伸95℃ 5 s；60℃ 20 s，共40个循环。引物采用在线设计软件：http：///tools/primer-blast/；管家基因U6为内参照，测得的数据用平均相对含量表示。引物由invitrogen合成，引物序列见表1。 　　1.4 统计学方法 　　采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，比较两组间差异采用t检验，相关性分析采用Pearso