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构建应用于生物学研究的组织工程肌腱 　　【摘要】 目的：构建应用于生物学研究的组织工程肌腱，为体外研究中检测胶原纤维的形态结构提供可行的方法手段。方法：培养大鼠肌腱细胞，构建无支架的组织工程肌腱，并检测其光镜结构和电镜结构。结果： 构建的组织工程肌腱表面光滑，结构紧密，细胞生存良好，细胞外基质分泌丰富。具有波浪形的胶原纤维，胶原纤维排列规则，直径大小相对均一，但小于正常肌腱纤维直径。结论：本研究构建的组织工程肌腱不含支架材料，结构与损伤肌腱类似，可以检测多种生物学指标，适于肌腱损伤修复的体外研究。 　　【关键词】 构建； 生物学检测； 体外研究； 组织工程肌腱 　　肌腱损伤修复是目前的研究热点之一。有研究发现某些细胞因子和细胞外基质能够影响肌腱的修复过程[1-3]。为了研究这些因子的作用，通常采用分子生物学技术提高或降低基因的表达，检测损伤肌腱修复效果的变化。研究中采用的模型有细胞模型和动物模型[4-5]。细胞模型便于应用基因调控手段导入目的基因或抑制相关基因的表达，并能够从基因、蛋白水平检测细胞的生物学变化，但是无法像肌腱组织一样观察胶原纤维的形态结构。动物模型便于观察组织结构，可以进行形态学研究，但是在进行基因手段干预过程中，需要构建病毒载体，实验周期较长，程序复杂，而且体内实验的影响因素也较多。所以本实验探索构建一种既方便用于基因调控手段干预，又能够进行形态学检测的组织工程肌腱，用于肌腱损伤修复的体外研究。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 试剂 DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、混合胶原酶，维生素C、甲醛、石蜡、无水乙醇、二甲苯、HE染液、Masson三色染液、戊二醛、锇酸、透射电镜组织包埋剂。 　　1.1.2 仪器 细胞培养箱、超净工作台、倒置显微镜（Olympus）、组织包埋机、切片机、透射电子显微镜（Quanta 10 FEI）。 　　1.1.3 实验动物 Sprague-Dawley （SD）大鼠，雌雄不限，体重250 g左右。 　　1.2 方法 　　1.2.1 培养肌腱细胞 取大鼠跟腱，剥离肌腱腱膜，将组织块剪成匀浆状，用混合胶原酶消化后，加入含10%FBS的DMEM，37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下进行原代培养。3 d更换一次培养基。当细胞铺满培养皿底约90%时，用胰蛋白酶消化按1：3进行传代培养。取P5以内的细胞用于实验。 　　1.2.2 构建组织工程肌腱 用高糖DMEM培养肌腱细胞，培养基中加入10% FBS和50 μg/ml维生素C，防止细胞老化和促进细胞外基质分泌。3 d更换一次培养基，培养两周后细胞外基质逐渐累积与细胞共同在培养皿底部形成连续的细胞片。用移液枪头尖部沿培养皿边缘慢慢卷起细胞片，形成长条形组织。继续培养一周，使细胞片光滑面与粗糙面充分融合形成组织工程肌腱。 　　1.2.3 检测组织工程肌腱的光镜结构 为了检测组织工程肌腱中细胞的生存状态和胶原纤维的形态特点，采用石蜡切片法制作组织学切片，分别用HE染色法和Masson三色染色法进行处理，在光学显微镜下观察结果。 　　1.2.4 检测组织工程肌腱的电镜结构 为了检测组织工程肌腱中胶原纤维的排列状态和直径大小，用戊二醛和锇酸双重固定标本，组织包埋剂包埋，制作超薄切片，在电子显微镜下观察结果。 　　2 结果 　　2.1 构建无支架的组织工程肌腱 图1A示体外培养的大鼠肌腱细胞，细胞生存状态良好。图1B示构建的组织工程肌腱，它不含任何支架材料，完全由肌腱细胞和细胞外基质构成，表面光滑，结构紧密。 　　2.2 组织工程肌腱的光镜结构 在光学显微镜下，HE染色的组织工程肌腱（图2A）显示肌腱细胞生存良好，散在分布，细胞外基质分泌丰富。Masson三色染色（图2B）显示组织工程肌腱内形成了连续的呈波浪式的胶原纤维。 　　2.3 组织工程肌腱的电镜结构 在透射电子显微镜下，胶原纤维横切处（图3A）可见胶原纤维直径大小相对均一，与正常肌腱组织中含有粗细不等的胶原纤维不同。胶原纤维纵切处（图3B）显示胶原纤维排列整齐，有明暗交替的周期性横纹。 　　3 讨论 　　本研究由体外培养的大鼠肌腱细胞成功构建了组织工程肌腱。该肌腱完全由肌腱细胞和细胞外基质构成，不含任何支架材料。所以在检测相关生物学指标时干扰因素较少。同时，它可以方便地应用RNAi、antisense等基因调控手段。该肌腱中细胞生存良好，细胞外基质分泌丰富，具有连续的呈波浪式的胶原纤维。可以用于检测肌腱细胞基因调控后胶原合成能力的变化，观察胶原纤维的形态结构，从而分析肌腱细胞中某些因子或细胞外基质的调节作用，为肌腱损伤修复带来有用的生物学信息。电镜结构显示，该肌腱中胶原纤维排列整齐，直径大小相对均一，与损伤肌腱组织类