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基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering 第十一章 遗传的分子基础（五） 本章要求 第一节 基因工程定义 第二节 重组DNA技术 第三节 重组技术与医学的关系 思考题 相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术与工农医等的关系 4.遗传工程 广义遗传工程包括: 　　生化工程、蛋白质工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程、基因工程及酶工程等。 狭义遗传工程是指: 　　基因工程(重组DNA技术)。 第 二 节 重组DNA技术 （一）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 （二）目的基因 cDNA (complementary DNA) 基因组DNA (genomic DNA) 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 （一）目的基因的获取 1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 第三节 重组技术与医学的关系 目 录 （一）疾病基因的发现与克隆 根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。 （二）生物制药 重组DNA医药产品 预防霍乱 口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗 预防乙肝 乙肝疫苗(CHO, 酵母) 利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗 单克隆抗体 抗组织损伤 超氧化物歧化酶 激活、剌激各类白细胞 白细胞介素 抗病毒感染及某些肿瘤 干扰素(? 1b, ?2a, ? 2b, ?) 治疗糖尿病 胰岛素 治疗侏儒症 生长素 刺激细胞生长与分化 生长因子(bFGF, EGF) 剌激白细胞生成 促红细胞生成素 剌激白细胞生成 颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子 促进凝血 血液因子VIII 抗凝 组织胞浆素原激活剂 功 能 产 品 目 录 基因诊断(genetic diagnosis)是利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。 （三）基因诊断 基本过程 区分或鉴定DNA的异常 分离、扩增待测的DNA片断 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒） 其他 二、重组DNA技术基本原理 基本原理 目的基因的获取 DNA导入受体菌 外源基因与载体的连接 克隆载体的选择和构建 重组体的筛选 克隆基因的表达 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 目 录 1.化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 2.从基因组DNA文库获取目的基因 目 录 限制酶切位点 限制酶消化 除去中间片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色体DNA 限制酶部分消化 外源DNA与载体DNA混合 连接反应 体外包装 用重组噬菌体 感染大肠杆菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文库 目 录 mRNA cDNA 双链cDNA 重组DNA分子 cDNA文库 反转录酶 载体 受体菌 复制 3.从cDNA文库获取目的基因 逆转录酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶Ⅰ 碱水解 T T T T 目 录 （二）克隆载体的选择和构建 （三）目的基因与载体的连接 1. 粘性末端连接 方式：(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接 Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ切割 载体DN