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国家自然科技资源平台 植原体菌种保藏技术规程（试行） 《自然科技资源收集整理保存技术规程研究制定》 项目组 二〇〇四年十二月十日 目 次前 言………………………………………………………………………………………2 引 言………………………………………………………………………………………3 1 范围…………………………………………………………………………………………4 2 基本原则…………………………………………………………………………………4 3 原理…………………………………………………………………………………………4 4 技术要求……………………………………………………………………………………4 5 操作方法与步骤……………………………………………………………………………5 参考文献………………………………………………………………………………………7 前 言 本规程由国家自然科技资源平台建设项目提出。 本规程起草单位：中国农业科学院土壤肥料研究所、中国科学院微生物研究所、中国林业科学研究院森林保护研究所、中国药品生物制品检定所、中国医学科学院医药生物技术研究所、中国兽医药品监察所、中国食品发酵工业研究院。 本规程主要起草人：田国忠、李永、朴春根、姜瑞波、顾金刚、周宇光、叶强、张月琴、陈敏、程池等。 引 言 植原体是一类无细胞壁的原核微生物，能侵染包括农作物、林木、花卉、杂草等植物，给农、林业生产带来巨大损失，近年来，此类病害在某些重要植物处于蔓延和加重的趋势。这类微生物尚不能在人工培养基上离体培养，其细胞结构、与寄主植物的互作等方面也有其明显不同特点，研究制定此类微生物的保藏技术规程，对于植原体菌种资源的规范和安全保藏、科学研究及合理利用具有重要意义。植原体菌种保藏技术规程 范围 本规程规定了植原体菌种保藏的基本原则、方法及技术要求。 本规程适用于各类植原体菌种的保藏。 术语与定义 植原体 phytoplasma 指寄生于植物韧皮部和介体昆虫体内的、具有三层单位膜结构的无细胞壁的原核生物。一般引起植物叶片黄化和发育畸形等症状。 植物组织培养 plant tissue culture 在无菌的条件下，将离体的植物器官和组织在人工控制的环境下培养，使其再生形成完整植株的过程。培养植原体—植物共生体即是培养已感染植原体病菌的植物外植体。 原理 植原体菌种尚不能在离体人工培养基上培养。被感染的寄主植物携带植原体，因而通过对植物茎段的繁殖，即可达到对所携带植原体的繁殖和培养。植物组织培养和营养繁殖，使植原体所受的选择压力较低，较低的温度条件可大大减缓植物和所感染植原体的代谢活动，从而减少菌株突变，降低繁殖速度，有效保持菌种原有性状。 技术要求 保藏方法 用组织培养法保藏感染植原体的植物组织，于5-25oC温度范围内保藏。 植物组织培养基 选用适于植物组织正常生长的培养基，不含四环素簇抗生素或其它对植原体生长和繁殖有抑制作用的成分。 培养温度和光照 培养温度20-28oC为宜。 光照强度在1000-3000 lx，光期为10-14h/d。 保藏温度和时间 常温保藏（20-28oC），保藏时间1-3个月。 低温保藏（6-10 oC），保藏时间6个月至1年。 注：保藏温度低于4oC会冻伤植物组织材料而导致植原体死亡。 保藏期检测 定期检查保藏菌种的房间、冷库、冰箱的温度、湿度。 检查各保藏试管有无杂菌污染现象，如发现杂菌污染，则取出该管重新移植，培养后补缺。 移植复核 大量植原体-植物共生体进行移植时，各菌株的编号、所用培养基需仔细核对无误。每次移植培养后，对照原保藏的菌株和菌种顺序号卡片名录，核实无误再行存放。 保藏指标 当获得的组培苗表现典型症状或在荧光显微镜下观察到特异植原体DNA荧光后即可进行菌株的保藏。 操作方法与步骤 带菌外植体采集 在田间采集表现典型症状的新鲜枝条，剪去叶和嫩稍，经酒精和升汞等消毒剂表面消毒后，截成具节茎段，移入培养基上培养。 无杂菌组培苗的获得 外植体长出新枝后，选无杂菌感染的外植体，截取新枝，移入新配制的培养基上培养和繁殖。如培养基被杂菌污染，将组培苗再进行表面消毒处理，移入新的培养基上培养，重复操作2-3次，直至获得无杂菌组培苗为止。 组织带菌鉴定 用DAPI荧光显微镜技术和PCR技术鉴定组织带菌状况和浓度。 DAPI荧光显微镜技术步骤：取植物幼茎、叶柄或根等，进行组织切片，厚度在100μm左右，用5％戊二醛固定2小时左右，用0.1M磷酸缓冲液（pH7.0）洗涤后，用1μg /ml 4’6－二眯基－2－苯基吲哚（DAPI）染色，最后置于落射荧光显微镜下检查韧皮部特异性植原体DNA荧光，激发滤光片波长为365nm,阻