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酶联免疫吸附试验技术简介 安徽省动物疫病预防与控制中心 2011.8 一、免疫检测的基础知识 免疫测定（immunoassay，IA）是应用免疫学技术测定样本的方法。在临床检验中主要通过抗原抗体反应检测体液中的抗体或抗原性物质。 ELISA是免疫测定技术中的一种 1　抗原 　　抗原是能在机体中引起特异性免疫应答的物质。抗原进入机体后，可刺激机体引起细胞免疫和产生抗体。 能在机体中引起抗体产生的抗原多为分子量大于5000的蛋白质，例如完整的病毒粒子、细菌等。 小分子化合物在与大分子蛋白质结合后能引起机体产生特异性抗体的，称为半抗原。例如某些激素、药物等。抗原的反应性取决于抗原决定簇（或表位）。一个抗原分子可带有不同的决定簇，例如细菌的荚膜多糖、类脂中可带有多个抗原决定簇。 2　抗体 2.1　抗体的结构 　　抗体是能与抗原特异性结合的免疫球蛋白(Ig)。 Ig分五类，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。 与免疫测定有关的Ig主要为IgG和IgM。 Ig由两个轻链（L）和两个重链（H）的单体组成。Ig的轻链是相同的，有κ和λ两种型别。 五类Ig的重链结构不同，这决定了它们的抗原性也不同。IgG和IgM的重链分别称为γ链和μ链。 　 重链和轻链的N端的氨基酸排列顺序因各种抗体而异，称为可变区，分别用VH和VL表示。两者构成抗体的抗原结合部位，只与相应的抗原决定簇匹配，发生特异性结合（见图），是抗体专一性结合抗原的结构基础。 2.2 　抗体的产生 机体被微生物感染后，先产生IgM抗体，然后产生IgG抗体。经过一段时间，IgM抗体（约占血清免疫球蛋白的10%）量逐渐减少而消失，而IgG（75-80%）抗体可长期存在，在疾病痊愈后可持续数年之久。 3　抗原抗体反应 3.1　可逆性 　　抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab Ag·Ab; 3.2　最适比例 在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物（沉淀）的量见图。曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围，称为等价带。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。如果抗原或抗体极度过剩，则无沉淀物形成，在免疫测定中称为带现象。抗体过量称为前带，抗原地过量称为后带。在用免疫学方法测定抗原时，应使反应系统中有足够的抗体量，否则测得的量会小于实际含量，甚至出现假阴性。 3.3　特异性 　　抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。 3.4　敏感性 化学比色法的敏感度为mg/mL水平； 酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/mL； 标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/mL水平。例如，用放射免疫测定法或酶免疫测定法测定口蹄疫抗体，其敏感度可达0.1ng/mL。 4　免疫测定在临床检验中的应用 　　由于各种抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制备特异性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原，因此免疫测定的应用范围极广，在临床检验中可用于测定： 1) 体液中的各种蛋白质，包括含量极少的蛋白质。 2) 激素，包括小分子量的甾体激素等。 3) 抗生素和药物。 4) 病原体抗原，如胶体金测禽流感病毒。 5) 另外，也可利用纯化的抗原检测标本中的抗体。 5． 标记的免疫测定 　　如上所述，免疫测定是一种很敏感的测定方法，抗原抗体反应后直接测定形成的沉淀或浊度，敏感度可达5~10μg/ml，但在临床检验中，某些待测物在标本中的含量远低于这一水平，因此要寻找增加敏感度的方法。 标记的免疫测定是将检测试剂中的抗原或抗体用可微量测定的物质加以标记，通过测定标记物来提高敏感度。 例如：在放射免疫测定和酶免疫测定中，标记物分别为放射性核素和酶，最后用测定放射性和酶活力来计算待检物的量，敏感度可比直接测定沉淀物提高数百至数千倍。在标记免疫测定中，一般加入过量的标记试剂以保证与待测物彻底反应。 以标记抗体（Ab※）检测抗原（Ag）为例： Ag+ Ab※ → AgAb※+ Ab※， 在反应产物中有与Ag结合的Ab※和游离和Ab※，如不将两者分离而测定标记物，测得的结果将为两者之和。因此，游离标记物与结合标记物的分离是标记免疫测定中的重要步骤。 可采用多种手段，固相载体是其中之一。如将抗原或抗体包被在固相载体上，然后再与标记的抗原或抗体直接反应，结合的标记物被固定在载体上，而游离的标记物留于溶液中。这样可以通过洗涤将游离的Ab※除去，结合标记物的测定可在固相上进