《NK杀伤实验.ppt

实验一 肿瘤细胞增殖抑制实验 （细胞活力分析仪） 原 理 Vi-CELL XR活力分析仪是视频成像系统，用于分析培养基或悬浮液中的酵母、昆虫和哺乳动物细胞。该分析仪可自动执行目前已被广泛接受的台盼蓝染色排除法，适用于多种细胞类型的分析。当细胞死亡，细胞膜破裂，从而使台盼蓝染料能够透过。结果，死细胞或已失去活力的细胞颜色比活细胞要深一些。通过对这种色调的对比测量，从而能够测量到细胞活力。 图像分析方案 贝克曼库尔特Vi-CELL XR系统可自动执行台盼蓝染色法。通过必威体育精装版的视频捕获技术和样品处理法，Vi-CELL XR将抽取细胞样品转移到流动池，然后照相机对其进行拍照。Vi-CELL XR至少可拍摄100张图像，以用于细胞活力检测。对细胞是否已吸收台盼蓝染料，可通过软件进行确定。吸收了台盼蓝染料的细胞，颜色要深一些，因此其灰度值较低。而具有高灰度值的细胞可视为活细胞。 与MTT法之间的比较 Vi-CELL细胞活力计数可对一个或多个实验组的总细胞数和死细胞数进行绝对计数，而MTT则通过测定活细胞所形成的甲臜溶解后的光密度值间接反映活细胞数量，二者的原理不同。 由MTT还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被DMSO溶解后才能检测, 会对实验结果的准确性产生一定影响；而且MTT从加入到进行检测需要4个小时，方法烦琐，耗时较长。Vi-CELL细胞活力计数法可即时检测，相对简单。 在进行贴壁细胞的检测时，MTT法可直接加入MTT，进行检测；而采用细胞活力计数法则必须将培养板中的细胞消化下来，再进行计数。 Vi-cell操作步骤 一、登陆样品 将至少为0.5mL（最多为2.0mL）的样品放入样品杯内。1. 将样品杯置于下一个可用的样品架位置。2. 单击Log in sample（登录样品）按钮，以登录样品。 在样品架上选择样品杯位置（适用时）。 输入Sample ID（样品ID）。注意不要使用特殊字符如[] 、= 、: 、 /等。 选择Cell type（细胞类型）。 如果样品已预先经过稀释，选择Dilution factor（稀释因子）。 单击OK（确定）。 按下Start queue（开始排列），即可开始进行分析。 二、选择细胞类型 在登录样品后，选择适当的细胞类型。如果细胞类型不存在，新建一个细胞类型。细胞类型可以通过单击导航栏上的细胞类型图标进行查看。 细胞类型图标 注意事项： 1. 细胞活力以百分比、浓度和细胞数表示。 2. 浓度检测范围在50,000-10,000,000个细胞/毫升。 3. 细胞直径在3-70μm。容许的最小直径为3μm。利用最 小直径可排除碎片和/或不需要的细胞。细胞类型容许的 最大直径为70μm。 4. 样品杯中样品至少0.5ml，最多2ml。 5. 试剂盒类型：绿色 - 缓冲液；红色 - 消毒剂；黄色 - 洗涤 剂；蓝色 - 台盼蓝试剂 6. 注意试剂盒试剂含量，更换备用试剂盒。 7. 处理废液注意安全 肿瘤细胞增殖抑制实验（MTT法） 原 理 四甲基偶氮唑盐 (MTT) 是一种黄色的染料。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，将淡黄色的MTT还原成蓝紫色、不溶于水的甲臜（Formazan）颗粒。该颗粒溶解后，其液体的吸光度值（A）与活细胞数及细胞代谢活性呈正相关。因此可根据光密度A值推测出活细胞的数目。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT 不会产生甲臜。 实验方法: 取对数生长期的U937细胞，台盼蓝染色检测细胞活性。 调细胞浓度为 5?104/ml, 接种于96孔板, 每孔100μl, 将不同浓度药物经倍比稀释后分别加入各孔中，分别设200ug/ml,100ug/ml,50ug/ml三组, 每种浓度3个复孔，另设细胞对照组。 对照组：100μl细胞 ＋ 100μl 培养液 各实验组：100μl细胞 ＋ 100μl抗肿瘤药物溶液 将培养板置于37℃, 5% CO2孵箱孵育48h. 5. 培养结束前4小时加入MTT（5mg/ml），10ul/孔。 6. 酶标仪检测各组A值，570nm为检测波长，630nm为参考波长。 7．计算不同浓度药物对U937细胞的增殖抑制率。 抑制百分率 = ( 对照组A570-630－实验组A570-630) / 对照组A570-630 ? 100%。 8．绘制增殖抑制曲线。 注意事项 1. 严格无菌操作，避免污染。细胞计数、加板要准确。 2. 采用不同浓度药物溶液进行实验时，必须进行倍