Fermentas常规限制酶疑难问题指南.doc

Fermentas常规限制酶疑难问题指南 默认分类 2010-08-10 11:08:59 阅读65 评论0 ??字号：大中小?订阅 1. 酶切不完全或不能酶切1.1. 限制酶失去活性。如果限制酶不能切割对照DNA： 检查限制酶是否过期。 确定限制酶是否在-20°C保存。 检查冰箱温度，温度不能低于-20°C，否则限制酶会被冻结。多次冻融循环(超过3次循环)会降低限制酶的活性。 1.2. 酶切条件未优化。采用针对限制酶和底物DNA类型的特殊酶切方法。 采用随限制酶配套提供的推荐缓冲液。常规限制酶双酶切时，参考Fermentas公司网页DoubleDigest?有哪些信誉好的足球投注网站引擎DoubleDigest?推荐的最佳酶切条件。 必要时选用添加剂。 酶切时选择推荐的优化酶切温度。嗜温性和嗜热性常规限制酶双酶切时，先用嗜温性酶切割1小时，然后升温再酶切1小时。 确保孵育过程酶切反应混合物的体积不会由于蒸发而减少，否则会导致盐浓度升高，从而降低限制酶活性。对于嗜热性限制酶，请选择具有加热阀帽的干浴设备，如PCR仪等。 1.3. 限制酶稀释方法不正确。采用特殊的限制酶稀释缓冲液(#B19)稀释限制酶。稀释后的限制酶在-20°C可以保存至少3-4个星期。 不要用水或10X反应缓冲液稀释限制酶。 无DNA存在时，不要用1X反应缓冲液稀释限制酶。 1.4. 反应体系配制不正确。限制酶必须是最后加入反应体系中的组分。 限制酶直接加入10X反应体系中可能会导致酶失活。 1.5. 反应体系中甘油过量。反应体系中的甘油浓度不能超过5%，因此加入到反应体系中的限制酶的体积不能超过总反应体积的1/10。 对高浓度甘油敏感的限制酶包括Alw21I、BpiI、Bsp68I、BspTI、Eco32I、Eco91I、EcoRI、Hin6I、HinfI、Mph1103I、Mva1269I和NcoI。 1.6. DNA浓度未优化。反应体系中DNA浓度的优化范围为0.02-0.1 μg/μl。1.7. DNA模板不合适或有污染。如果对照酶切结果表明限制酶有活性，需进行混合实验。将底物DNA溶液与对照DNA(如Lambda DNA (dam–, dcm–))混合后酶切，分析底物DNA溶液中可能存在的限制酶切的污染物。对照酶切的反应体系含有两种模板：对照DNA和样品DNA。反应体系中DNA的优化浓度范围为0.02-0.1 μg/μl。 如果对照DNA和样本DNA都不能酶切(见1.8)，说明样本DNA有污染。 如果对照DNA可以酶切，而样本DNA不能酶切，说明样本DNA没有污染。样本DNA酶切效率差的主要原因是DNA序列存在错误(见1.9)、甲基化影响(见1.10)和DNA底物结构(见1.11)等因素影响。 注意确保对照DNA中含有限制酶的识别位点。如Lambda DNA中无NotI识别位点。1.8. DNA溶液有污染。模板DNA可能有SDS、EDTA、蛋白、盐和核酸酶残留。采用分离柱纯化试剂盒或酚/氯仿抽提和乙醇沉淀方法再次纯化模板DNA。70%冷乙醇洗脱沉淀以除去EDTA和盐，纯化后DNA的A260/280 比例必须在1.8-2.0之间。 GeneJET? Plasmid Miniprep Kit常用于稳定和可重复的少量纯化质粒DNA。 如需酶切未纯化PCR产物，PCR产物需用1X限制酶缓冲液稀释至少3倍。 如果用硅石或树脂重新悬浮纯化模板DNA，需采用10,000rpm离心10分钟，确保溶液中无硅石或树脂残留。另外离心后吸取上清的动作要轻柔，不要将硅石或树脂带入新试管中。 1.9. 底物DNA无限制酶识别序列。重新检查DNA序列和克隆方案。 确认限制酶达到100%切割活性是否需要多个DNA识别序列(见1.11.3)。 查找资料了解限制酶的位点偏好性(见1.11.4)。 如果识别序列是由PCR引物引入的，分析引物序列是否含有识别位点。 1.10. 甲基化影响。限制酶切割效率受识别位点甲基化影响 分析识别位点甲基化类型，确定甲基化是否影响或阻止酶切。 如果甲基化影响或阻止DNA切割： 在E.coli dam–, dcm– 菌株中繁殖质粒(例如E.coli GM2163 dam–, dcm–菌株，#M0099。客户在购买Fermentas公司产品的同时可免费索取该菌株)。 通过Fermentas网页REsearch?有哪些信誉好的足球投注网站引擎REsearch?或在Fermentas目录中查找对DNA甲基化不敏感的同裂酶。 DpnI(酶切时要求识别序列甲基化)常用于切割未甲基化的DNA。在此情况下，DpnI的异功酶Bsp143I或MboI可用来切割未甲基化的DpnI识别位点。另外，也可以在E.coli dam+