《实验三+伪狂犬病抗体检测.ppt

实验四、伪狂犬病抗体检测（阻断ELISA) 酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) 一、实验目的 了解ELISA的原理和类型 掌握阻断ELISA操作程序 二、实验原理 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性； 抗原或抗体可通过共价键与酶形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； 酶结合物催化底物发生化学反应，根据颜色的有无和深浅判定抗原抗体反应的发生与否。 间接法（Indirect ELISA） 阻断法（Block ELISA) 双抗体夹心法（Sandwich ELISA) 竞争法（Competitive ELISA) 三、实验材料 酶标板，酶标仪 包被缓冲液：0.025M pH9.6碳酸盐缓冲液 猪伪狂犬病毒（PRV） —— 抗原 样品稀释液： pH7.4 PBS 阴性对照（EP管中，已稀释） 阳性对照（EP管中，已稀释） 样品 —— 待测猪血清（EP管中，已稀释） AP标记猪PRV单抗—— 酶标单抗（EP管中，已稀释） 洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS（青瓶） 底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液 底物溶液：TMB（四甲基联苯胺），底物缓冲液，30% H2O2，新鲜配制 终止液 四、实验方法 取稀释好的被检血清2份和阴、阳性对照血清，每孔加入100μl，置37℃温育30分钟。 洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200μl，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复3次。 每孔加酶标单抗100μl，置37℃温育30分钟。 洗板：同步骤2。 显色与终止：每孔先加底物A液、再B液各1滴(50μl)，混匀，室温（18-25 ℃）避光显色10分钟后。 终止：每孔加终止液1滴(50μl) （0.25% 氢氟酸），终止反应。 10分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定OD值。 结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD630值与阳性对照孔平均OD630值之差≥0.4。 S=样品孔OD630值，N=阴性对照孔OD630值 如果S/N比值≤0.6，样品判定为PRV抗体阳性; 如果S/N比值≤0.7但 0.6，样品可疑; 如果S/N比值 0.7，样品判定为PRV抗体阴性。 五、结果与分析 阴阳性对照样品的OD630 ＝? S/N＝?，被检血清是阴/阳性？ 结果与预期的不符，可能的原因是什么？ 预期结果 阳性：无色 阴性：蓝色 六、注意事项 ELISA前血清样品37℃灭活30分钟。 在ELISA的整个操作过程中，洗涤是非常重要步骤，目的在于防止引起非特异性吸附，洗涤时尽可能除去未结合的抗原及杂质，用力甩干。 加入底物液后应室温避光，结果判断须在10分钟内。 实验中保持安定，不要随意走动、讨论不相关的事情。 思考题 间接ELISA和阻断ELISA有什么异同？ 伪狂犬的抗体检测方法还有哪些？ * Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. 将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，从而使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在。 Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd. （1）间接法测定抗体 A. 将抗原吸附于固相载体表面； B. 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; C.?加酶标抗体； D. 加底物。测定底物的降解量＝抗体量。 Evaluati