羧甲基壳聚糖对变形链球菌表面疏水性及黏附力的影响.docVIP

羧甲基壳聚糖对变形链球菌表面疏水性及黏附力的影响 　　[摘要] 目的 研究羧甲基壳聚糖对变形链球菌表面疏水性及黏附能力的影响。 方法 采用微生物黏着碳氢化合物法（MATH）测定不同浓度的羧甲基壳聚糖对变形链球菌表面疏水性的影响；并采用不同浓度的羧甲基壳聚糖与变形链球菌共同培养计算羧甲基壳聚糖对变形链球菌的黏附率的影响。 结果 不同分子量的羧甲基壳聚糖浓度为0.16 g/L时可降低变形链球菌表面的疏水性，并抑制变形链球菌在光滑玻面的黏附。 结论 羧甲基壳聚糖可以有效抑制变形链球菌的疏水性及黏附能力。 　　[关键词] 变形链球菌；羧甲基壳聚糖；疏水性；黏附力 　　[中图分类号] R285.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）07（c）-0129-03 　　变形链球菌（Streptococcus mutans，S.mutans）是公认的口腔主要致龋菌[1]，具有高度黏附于牙面的能力，变链菌在牙面上黏附和定植是变链菌致龋的始动因子[2]其黏附过程经历两个阶段后形成菌斑生物膜。第一阶段变链菌表面蛋白与获得性膜中宿主因子之间相互作用形成初始黏附，即非蔗糖依赖性黏附。第二阶段变链菌的葡糖基转移酶（glueosyltransferase，GTFs）利用蔗糖合成水不溶性葡聚糖来介导该菌的蔗糖依赖性黏附、集聚。变链菌通过黏附定居于牙面，形成致龋性微生态环境牙菌斑，利用糖产酸，导致牙齿脱矿，产生龋病[3]。细菌表面疏水性（cell surface hydrophobicity，CSH）是细菌非特异性黏附的重要部分，研究表明，细菌表面疏水性在细菌对牙面及口腔上皮细胞的初始黏附中起着重要作用，表面疏水性越强的细菌黏附力越强[4]。目前寻找安全有效的防龋物质是龋病防治研究的重点。羧甲基壳聚糖对诸多口腔细菌均有一定的抑制作用[5]，并具有良好的生物相容性和可降解性，可形成凝胶或膜状结构，尤其适用于口腔。目前对其在防龋方面的研究主要集中在抑菌方面，而对其防龋机制的研究报道较少。 　　本研究采用微生物黏着碳氢化合物法（microbial adhesion to hydrocarbons，MATH）[6]，测定不同浓度的羧甲基壳聚糖对变形链球菌表面疏水性的影响及在玻壁表面的黏附作用，探讨其影响变形链球菌黏附的作用机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验材料 　　3种羧甲基壳聚糖，平均相对分子质量（MW）分别为5500、10 000、12 000，脱乙酰度（D.D）均为90.6%，由青岛海汇生物工程有限公司提供；TPY培养基，由北京陆桥技术有限公司提供。十六烷（沃凯），购自国药集团化学试剂有限公司（上海）。BHI培养基：OXOID LTD，Basingstoke，Hampshire，England。实验菌株变形链球菌Streptococcus mutans，S.mutans ATCC 25175，菌株由四川大学口腔生物医学工程教育部重点实验室提供。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 菌液调整 将变形链球菌ATCC25175冻干菌株复苏并接种于BHI固体培养基中，在37℃（80%N2、10%H2、10%CO2）厌氧培养48 h，经鉴定后，转移到含2%蔗糖的BHI液体培养基中，于37℃（80%N2、10%H2、10%CO2）条件下厌氧箱培养24 h。以2500 r/min离心15 min（离心半径13.5 cm），收集细菌，PUM缓冲液洗菌3次，每次3 mL。用PUM缓冲液作为空白对照，将紫外可见分光光度计调零，用PUM缓冲液调在660 nm波长处吸光度A = 0.5的菌悬液。 　　1.2.2 实验分组 实验分为空白对照组及实验组。空白对照组的菌体用PUM缓冲液处理（不含羧甲基壳聚糖溶液）3 mL；实验组分别为含不同分子质量不同浓度的羧甲基壳聚糖的BHI培养基3 mL，浓度分别为：5，2.5，1.25，0.64， 0.32，0.16 g/L，共7组。以上实验组和对照组每组4个平行管，共计84管。 　　1.2.3 疏水性测定 采用微生物黏着碳氢化合物[6]（microbial adhesion to hydrocarbons，MATH）测定不同浓度的羧甲基壳聚糖对变形链球菌表面疏水性的影响。调整菌悬液的吸光度A = 0.5取3 mL加入羧甲基壳聚糖溶液的试管中，混和均匀，再将其放置在水浴箱中，调整水浴箱的温度为37℃孵育15 min，取3 mL，加入400 μL十六烷，剧烈震荡60 s，使各个试管充分混和均匀。然后再静置15 min，使试管中的羧甲基壳聚糖溶液分为上下两层，其上层为油层，下层是水层，取油层进行革兰染色，显微镜下观察细菌；保留水层，用紫外可见分光光度计在660 nm波长处测定各个试管的