《确认试验.ppt

确认试验 特异抗原确认：中和试验（HBSAg) 特异抗体确认：免疫印迹或荧光抗体试验（抗-HCV） 为什么要做确认试验 导致假阳性原因 Cut-off的设定 内源性干扰 外源性干扰 试剂质量和实验操作的不精密度 CUTOFF？ CUTOFF值是鉴别样品，作为判断特定疾病、状态或被测量存在 或不存在的界限的量值； 测量结果高于临界值判断为阳性； 低于临界值判断为阴性； 测量结果接近临界值判断为非确定性； 临界值的选择决定检验的诊断特异性和诊断敏感性。 CUTOFF及灰区的确定 5000份非HBV感染者血清标本 均值0.06 标准差0.019 Cut-off 0.11(0.06+2.58×0.019) 2000份随机选取的HBsAg阳性血清标本 均值1.50 标准差0.628 Cut-off 0.08(1.50-2.58×0.628) 使用正态分布u检验，根据99.5%单侧的可信限, 可分别得到决定反应性和非反应性的两个Cut-off值， 处于该两个Cut-off值之间的值归为“灰区”。 CUTOFF值验证 验证方法1: 采用临界浓度的标准品(可要求厂家提供),连续检测20次,95%的结果 落在临界范围即可. 验证方法2: 连续统计一段时间的检测结果,处于临界范围的结果比例小于5%即可. 验证方法3: 临界值?20%浓度样本阴阳性符合率≥95%即可 验证方法4: 阴、阳性样本的CUTOFF值验证 阳性样本的CUTOFF值验证 选择弱阳性（CUTOFF值+20%附近）新鲜血清或质控血清共120份 ?分3-5批3-5天进行检测 ?计算均值（X）、标准差（SD） ?CUTOFF验证值为：X-3s ?设定的CUTOFF值小于验证的CUTOFF值，即为验证通过。 阴性样本的CUTOFF值验证 选择60份健康人新鲜血清和60份目标标志物阴性而有其他免疫标志物阳 性的患者新鲜血清共120份， 分3-5批3-5天进行检测 计算均值（X）、标准差（SD） CUT OFF验证值为：X+3SD 设定的CUTOFF值大于验证的CUTOFF值，即为验证通过。 内源性因素 类风湿因子 补体 高浓度的非特异性免疫球蛋白 异嗜性抗体 某些自身抗体 外源性因素 标本溶血：血红素基团有类似过氧化物的活性 标本污染：细菌的内源性酶会产生非特异性干扰 标本贮时间过长：IgG可聚合成多聚体，导致本底过深，甚至造成假阳性 标本凝固不全：残留部分纤维蛋白原 试剂盒原材料的纯度、组合、来源等也会造成结果的假阳性或假阴性 其它因素 测定方法的不精密度 实验操作、样本采集、样本前处理 HBsAg的确认 HBsAg测定中的问题 敏感性：献血员中所发现的HBsAg 携带者最低含量为0.2ng/ml，而国产 ELISA试剂的敏感性水平多为0.5ng/ml左右。 钩状效应：血液中HBsAg含量最高2000000ng/ml，而HBsAg各种检测方法的线 性检测范围上限均不超过50ng/ml。 定量测定：Dane颗粒中存在乙肝病毒，但其仅占所有HBsAg的0.2%，所以 HBsAg和乙肝病毒之间缺乏正相关。 特异性：目前的各种检测方法均有出现假阳性结果的可能性，这种情况在 弱反应性的标本中更为常见。 HBsAg确认试验的基本原理 在阳性样本中加入抗HBs特异抗体试剂，与相应未加入特 异抗体的相同样本的检测结果作比较，如果出现A值明显降 低，则表明样本含有HBsAg，即为真正的阳性，A值没有明显 降低的,则为假阳性。 HBsAg确证试验 强生HBsAg确认试剂盒 试剂： 1. HBsAg确认试剂盒 2小瓶冻干确认抗体试剂 2瓶标本稀释液 2. 配套使用强生HBsAg ES试剂包 强生HBsAg确认试剂盒操作步骤 1.分别取200μl经HBsAg ES反复测试有反应性的标本血清或 血浆（肝素抗凝），加到两个样品杯中，做标记A和B 2.加50μl样本稀释液于A中，加50μl试剂抗体于B，混匀 3.均置于15-30摄氏度孵育至少15分钟，最多不超过8小时。 （孵育超过2小时应该给样品杯加上防蒸发盖） 4.在样本编程中选取HBCON，分别编辑特殊ID给A和B，