PCR常用优化略.doc

PCR常用优化策略 0 e, }+ J4 _) @! p, ] R? ???特异性、有效性和忠实性是检验PCR扩增效率的三个指标。PCR的高特异性是指PCR反应只产生预期的靶序列。PCR的有效性是指经过相对较少的PCR循环能获得更多的产物。而PCR的忠实性则是指PCR反应的精确性，其产物中几乎没有由DNA聚合酶诱导的碱基错配。理想的PCR反应应该体现高度特异、高效和忠实。研究表明这三个参数都受到PCR反应体系中的众多成分及反应参数的影响，并且使PCR反应获得高度特异性、高度忠实性、高产量的条件并不一致。因此，我们在建立PCR反应时，必须明确哪一个参数对于预期的扩增是最为重要的，并据此优化反应条件。PCR过程中如果没有找到最佳的扩增条件将会导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；而在另一个极端，又可能没有扩增到任何产物。这时，改变已知的对引物－模板的忠实性和引物延伸有影响的诸多参数中的一两个，将会达到优化扩增的目的。其中最主要的优化变量包括 Mg2＋浓度、缓冲液pH值和循环条件，在循环条件中又以退火温度最为重要。 , Y1 F2 e7 Y??e0 L1. 模板核酸：模板核酸可以为多种形式的DNA，可以预先纯化除去蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以及能与DNA结合的蛋白质。理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩增最好只向反应体系中加入单一拷贝的靶序列DNA作为模板，但其PCR产量较低。实验表明，在一定范围内PCR的产量随模板的浓度的升高而显著升高。为了获得较高的产量同时保证较高的反应特异性，通常PCR反应的模板加入量为102－105拷贝的靶序列。需要指出的是，扩增相同拷贝数的靶序列时，向PCR反应体系中加入的含靶序列的模板核酸的量是不同的。例如，3×105单拷贝的靶分子相当于1?g人基因组DNA、10ng酵母DNA和1ng大肠杆菌DNA，而1% M13噬菌体相当于106靶分子。; o: F+ ^5 n7 P3 {( y$ Y2. 加入增强剂：一系列辅助物如DMSO（1%～10%）、PEG－6000（5%～15%）、甘油（5%～20%）、非离子去污剂、甲酰胺（1.25%～10%）和牛血清蛋白（10～100μg/mL）等都可以作为增强剂加到反应中以提高特异性和产量。大多数的PCR反应促进剂在高浓度时将会抑制PCR反应。因此在具体实验中应根据PCR反应体系中特定的模板DNA和引物的结合情况来决定PCR反应促进剂的最适浓度。通常在优化PCR反应体系时，应当首先考虑优化反应体系中的常规组成成分，尤其要考虑Mg2+和K+的浓度。 c x/ s3 q) W ?1) DMSO：DMSO有变性DNA的作用，使用10%的DMSO对大肠杆菌DNA聚合酶Klenow I片断是有益的，但是对Taq DNA聚合酶有抑制作用，因此在一般反应中应尽量不用DMSO。然而，在复合PCR中可以用。8 R??H, K* A R, q2) 甘油：在反应体系中加入5%－20%的甘油有利于PCR反应中的复性，尤其对GC含量高和二级结构多的靶序列以及扩增片段较长的PCR反应中更为适用。但DMSO和甘油并非对所有的PCR反应都有益，应当根据实验的具体情况确定是否在反应体系中加入这些试剂。 e# w( ] F3 h7 \8 y* I3) TMAC：在反应体系中加入1×10-4~1×10-5mol/L的TMAC可促进PCR反应，去除非特异性扩增而不抑制Taq DNA聚合酶。0 X3 C, l+ {# u5 \# Q* X0 ?0 z4) T4噬菌体基因32蛋白质(gp32)：向PCR反应体系中加入0.5~1?l的gp32(1mmol/L)可改善DNA聚合酶对长片段DNA的扩增。 j% m Y j+ w??]??n8 w: b e6 ?; M7 ]??X??_9 i; v 影响PCR反应的PCR反应促进剂的浓度 名称 抑制 促进 DMSO? ? 10% 5% PEG 20% 5－15% 甲酰胺? ? 10% 5% 甘油 20%?? 10－15% Tween 20? ? 未测定 0.1%－2.5% 3. Mg2＋ 浓度调整 ：Mg2＋浓度是一个最容易控制的参数，因为所有的浓度变化都可以在不同的反应管中同时进行。Taq DNA聚合酶的供应商现在除了提供标准缓冲液外还单独提供MgCl2溶液，以简化Mg2＋浓度的调节。一个典型的两步优化过程可以首先包括Mg2＋浓度增幅为0.5mmol/L的从0.5mmol/L到5mmol/L的一系列反应；当8 {5 z??a: i FMg2＋浓度范围缩小以后再做第二轮优化，采用几个增幅为0.2或0.3mmol/L的Mg2＋浓度。另外其他的离子如NH4+ K+都会影响PCR。增加K+的浓度后, 因为中和了