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PDQuest Bio-Rad蛋白质组双向电泳图象分析软件讲义 ProteomeWorksTM System  此讲义教你如何跟着Quick Guide实现2D实验以后的图像处理分析 题目的设计：你想知道E.Coli在热休克状态下蛋白的表达情况，设计了一个实验组和一个参照组实验，其中参照组是37度培养的E.Coli，实验组是42度培养的E.Coli,图像分别存为half1.gsc 和half2.gsc（到Program Files/Bio-Rad/The Discovery Series/Sample Images/2d/Rad 35S dilutions下可找到这两个文件）。现在的问题是你要对这2张图进行分析，找出有差异性的蛋白点。 提示1：如果你对PDQuest没有任何了解，请放弃此讲义，先获取对PDQuest的基本了解（说明书，教学软件，在软件上先练习一下） 提示2：不要希求一个软件能解决你的所有问题，软件的自动化水平能加快你的工作进度，但并不意味着你可以“傻瓜”，请先问问自己实验的目的是什么，希望出什么样的报告结果 提示3：再给你增加一点信心，德国一家中立机构对市场上几乎所有的2D分析软件进行了一个评测，结论是PDQuest是速度最快，出错率最低的 现在开始我们的分析进程吧。 打开PDQuest软件你能看到一个PDQuest Analysis Quick Guide, 建议你跟着这个Guide一步步往下做。 贴士1：如果看不见这个Guide,去Help菜单下选中Quick Guide，点击Guide右下脚按钮可以改变它的大小。 打开你要比较的文件。 贴士2：原来你熟悉的Ctrl,Shift等复选键都是可用的。 2．Crop修剪图像，一般要求比较的图像大小差不多，经常的情况是：一你扫描/拍下来的图 像大小不一样；二图像的边缘有很多条纹/重叠等混乱。用Crop把图像剪成一样的大小（至少是差不多大小的，这可加快你下面的分析速度）。 贴士 3：怎么知道一张图像的大小等信息呢？单击鼠标右键(Image Info…，可以看到图像的大小，成像日期，用什么仪器成像的，文件大小等信息，还有一个History,告诉你之前这张图经过了你的什么处理，如Crop，你还可以在Description一栏中输入点你想说的信息。 贴士4：Imager菜单下有个Advanced Crop命令，可以把你Crop的大小/位置信息保存(save)下来，让你下次调用(load)，这样方便你每次能剪切出大小一致的图。 3．Automated Detection and Matching自动斑点检测和匹配，这个命令集成了2个很重要的 功能：蛋白点的自动检测和图像间的自动匹配。 贴士5：这2个功能当然也可以分开实现，Spots 和Match菜单下有相关的命令，你可以自己试一下。 3．1现在你看到的是Automated Detection and Matching窗口，注意一下Step1,2,3,4，PDQuest有个特点就是把比较复杂的功能给你Step了，这样你可以一步步往下做。 Step1-Select Gels to Analyse窗口里你看到的文件名是你要分析的文件，你可以在这里Add/Remove文件，记住选择Master胶，如选择half1作为Master 贴士6：如何来理解Master胶呢？一开始Master总是某一张你要分析的胶，所以简单地你可以把参考实验胶作为Master;但事实上Master可以赋予它更多的内容，Master是一张假图，也就是说没有这样的一个实验存在，既然是假图，你就可以根据需要来“画”它，比如你可以把所有的点都加到Master中去（使Master成为一张所有的点的集合，怎么加，见第5步）。 3．2 Step2-Detect Spots on Gels斑点检测，点击Edit,进入Spot Detection Parameter Wizard斑点检测窗口，左边是预览窗口。检测过程是点一个最弱的点Click on a faint spot，(不用做Click on a small spot),用鼠标框出一个最大的点Box the largest spot cluster，然后Find Spot Center,你就可以预览到斑点检测情况了。黄+标记代表每一个斑点，Spot Count告诉你斑点总数。你可以在这个窗口里反复地重复Click on a faint spot这一步骤，直到满意。预览的结果满意后你就可以“真正”来检测了，点击Process All Gels，跳出来的窗口要求你输入Parameter Set的名字，这是因为软件自动根据你的选点计算出一系列