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B.39. 体外哺乳动物肝脏细胞非常规DNA合成测定
1.方法
这个方法是世界经济合作与发展组织TG 486的重复。用哺乳动物样品的肝脏细胞进行的体外非常规DNA合成(UDS)测定(1997)。
1.1. 引言
用哺乳动物样品的肝脏细胞进行的体外非常规DNA合成(UDS)测定的目的是为了证实测试物质能够诱导实验动物肝细胞内的DNA修复。(见1.2.3.4)。
这个在体内进行的测定提供了研究肝脏中化学物质作用的方法。最终要测量的是DNA的损害和随之而来的修补的表征。肝脏通常是所吸收化合物新陈代谢的主要场所,因而它成为测量DNA损害的合适场所.
如果证明测定物质不能到达目标组织,用这个测定是不适合的.
非常规DNA合成(UDS)测定的终点通过限制细胞中并未经历预定的DNA合成法被标明的核苷的吸收来测量.用的最广泛的技术是用氚标记的胸腺嘧啶核苷(的吸收。鼠的肝脏最适合UDS测定。用的是组织而不是肝脏,但这不是这方法的主题。
UDS响应的探测取决于在损害部分减少或取代的DNA母链的数目。总之,UDS测定对测定物质引起的长斑点修补最有价值.。相反短斑点修补,灵敏度就低得多。此外,由于DNA损伤的不修补,错误修补或错误复制将导致引起突变的状况。UDS测定影响的延伸没有给出修补过程是否正确的表现。另外,DNA能引起突变的反应,但是,DNA损伤并不是通过一种切除、修补过程来修补的。UDS测定所提供的关于能引起突变的行为方面的详细实验数据的缺少,可以由这个终点的潜在敏感性来抵消,因为这是在整个整组基因中进行的。
又见B部分的总引言。
1.2. 定义
修补中的细胞:网状核微粒(NNG)高于预先设定值,这个在实验室测试中被证明。
网状核微粒(NNG);在放射自显影的UDS测定中,细胞UDS活性数量上的测量,通过从核微粒的数目(NG)减去在细胞质区域的细胞质微粒的平均数目(CG)来计算:NNG=NG-CG。NNG数先是用个体细胞数再是同一特性的、平行特性的等等的细胞集中起来算。
非常规DNA合成(UDS):在切除或转移一段包含有因物理化学因素而导致的损伤的DNA片段后的DNA修补合成。UDS测定表明这个测定通常基于在细胞循环S-phase中有低频率细胞(标记的肝脏细胞DNA的合并。(的吸收通常由自动射线照相术法来限制。基于这项技术不像S-phase细胞引起影响液体闪烁计数。
1.4. 方法描述
1.4.1 准备
1.4.1.1动物种类的选择
通常用大鼠,但其它种类适合的哺乳动物也可使用。应利用实验室通常使用的种类的年轻健康的成年动物。研究开始时,对每个性别动物体重的变化必须最少不超过通常体重的%。
1.4.1.2 居住和喂养条件
虽然温度的目标应在50%~60%,总的条件参考文献B部分的总引言。
1.4.1.3 动物样品的准备
健康年轻的成年老鼠随机分配给各个对照组和测试组。笼子应按所占地方最小引起的可能影响来安排。动物要确认唯一并至少在研究开始前关在笼子里5天,保证它们适应实验室的条件。
1.4.1.4 测定物质/准备
固体测定物质应溶解或悬浮在合适的溶剂或赋形剂中,如果可能,在给动物喂食前稀释。液体测定物质直接喂或在喂前稀释。可利用测定物质的新鲜储备,除非固定实验数据证明库存也适合。
1.4.2. 测定条件
1.4.2.1. 溶剂/ 媒介物
溶剂/ 媒介物在所有剂质量标准上不能毒性害作用,也不能与测定物质起任何化学反应。如果除了所用的有名的溶剂/ 媒介物,它们所包含的东西应有表明它们适合性的实验数据支持。建议是只要有可能,似水的溶剂/ 媒介物的使用应优先考虑。
1.4.2.2 对照组
同时的阳性和阴性(溶剂/ 媒介物)对照必须包括在实验的每个独立的操作部分。除了测定物质的处理,对照组的动物必须与处理组的动物用同样的方法处理。
阳性对照必须是在暴露标准管理时已知能产生UDS的物质,这样才能在背景上给出一个可察觉的增长。需要变化活化作用的阳性对照必须在能引出合适的响应剂量伤使用。剂量可以选择在影响很清楚但又不是马上向读者显出编码幻灯片的本身。阳性对照物质的举例包括:
取样时间 物质 CAS No. EINECS No. 早期取样时间(2-4小时) N-亚硝基二甲胺 62-75-9 200-249-8 末期取样时间(12-16小时) N-2-Fluorenylacetamide(2-AAF) 53-96-3 200-188-6 其它合适的阳性对照物质也可使用,正面对照必须由不同于测定物质的方案来管理,这些普遍被接受。
1.5. 实验步骤
1.5.1. 动物样品的种类和性别
考虑到在测定影响中自然生物上的变化,必须使用适量的动物,至少是每组三只可分析的动物。正如一个著名的历史实验数据库曾记载的
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