RT-PCR实验心得.doc

RT-PCR实验心得 1.取中号培养瓶(100ml培养瓶 注:此时细胞汇合度≥80%),用PBS洗细胞两次，弃尽PBS后加2mlTRIzo?细胞用用吹打管吹至液体澄清且无细胞团块转至2个1.5EP管中. 2.颠倒摇晃10下，室温5分钟. 3.在2个EP管中各加入0.2 ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒并将其在30°C下孵育2—3分钟。 4.在2—8°C下用不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。 5.用移液枪分别转上层水相（约500-600μl）于另二个1.5mlEP管中,加等体积异丙醇（约500-600μl），混匀室温10分钟来沉淀RN→在2—8°C?下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心10 分钟。注:移液枪的枪头不宜伸入液面太深,以防洗上中层液体!;离心前注意放管的方向,此时RNA沉淀形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。 舍弃上清,用75%的乙醇(用DEPC水处理的,临时十分钟配,预冷保存于4°C或-20°C) 1 ml来洗涤RNA沉淀→在2—8°C下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。;离心前注意放管的方向, 注:旋涡振荡混合样品;RNA在75%乙醇中，2-8℃至少可保存一周，-20℃至少可保存一年! 7 弃上清，置于卫生纸上，自然晾干（不能完全干燥）,用20-50μl DEPC水溶解。(建议装于0.6的EP管中.) 8 注:该步后,可保存于-70 ■ RT反应体系注意事项 1.RT试剂盒中试剂解冻后,?摇晃试管使其均匀,在稍离心,放于冰盒上.反应也在冰上操作. 2 PCR仪预热到50°C,在放PCR管于PCR仪上(之前在冰上!)开始逆转录. 4 RNA的量宜大2ug/reaction! 5 要有要有逆转录(530min)和初始热活化(9 15 min); ■Reaction components for one-step RT-PCR using Q-Solution（我的一步法） Component Volume/reaction Final concentration Master mix ? ? RNase-free water (provided) ? – 5x QIAGEN OneStep RT-PCR Buffer* 10.0/5 μl 1x dNTP Mix (containing 10 mM each dNTP) 2.0/1 μl 400 μM of each dNTP 5x Q-Solution 10.0/5 μl 1x Primer A ? 0.6 μM? Primer B ? 0.6 μM? QIAGEN OneStep RT-PCR Enzyme Mix x 2.0 /1μl – Template RNA ? 0.5/1 pg – 1/2 μg/reaction Total volume 50.0/25ul _ 注:引物/内参在反应体系中的浓度为20μM. 反应体系要搞清! ■PCR反应体系 step ? time temperature Reverse transcription ? 30min 5 Initial PCR activation step 15 min 95℃ 3-step cycling ? Denaturation ? ? Annealing ? ? Extension ? ? Number of cycles ? ? ? Final extension ? ? ? GAPDH：(+)5-CTGCACCACCAACTGCTTAG-3；//(-)5-TGAAGTCAGAGGAGACCACC-3 扩增片段长度为407bpGAPDH条件为预变性94℃ 3 min，94℃ 40 s、59度40 s、72度1 min 7个循环，94℃ 40 s、56度40 s、72度1 min 25个循环，72℃延伸5 min。 bcl-2:(+)5-CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC-3//(-)5-CCGCATGCTGGGGCCGTACAGTTCC-3 扩增片段长度为319bp。bcl-2扩增条件为94℃4min，94℃ 30s、63℃ 30s、72 ℃ 1min,33个循环,72℃ 7min；bax扩增条件为94℃5 min, 94℃ 30s、63℃ 30s、72 ℃ 1min,94℃ 1 min，31个循环, 72℃ 7min。 ■电泳 1 电泳缓冲液: 0.5×TBE:工作缓冲液0.5×TBE,我的是10×TBE的浓缩液, 100ml 的10×TBE的浓缩液加入1900的三蒸水,既是为0.