Western_Blot_蛋白印迹法.doc

Western Blot 蛋白印迹法 －－详细中文操作指南（新手适用） ? 这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。 ? 仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。 试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、0.15mol/L NaCl 溶液、2X（5X）SDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、10X丽春红染液、封闭液、TBST、TBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、定影液、抗体、化学发光试剂。 杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸， ? 试剂配制： （一）母液 1.0mol/L Tris·HCl Tris (MW121.14) 30.29g 蒸馏水 ??????????200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至所需点（见下所示），最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 PH??????????????????? ?HCl 7.4?????????????????? ?约17ml 7.5??????????????????? 约16m 7.6 ???????????????????约15ml 8.0??????????????????? 约10ml ? 1.74mg/ml (10mmol/L)PMSF PMSF ????????0.174g 异丙醇 ??????100ml 溶解后，分装于1.5ml离心管中，－20℃保存。 ? 0.2mol/L NaH2PO4 NaH2PO4（MW119.98）?? ?12g 蒸馏水??????????? 至 500ml 溶解后，高压灭菌，室温保存。 ? 0.2mol/LNa2HPO4 Na2HPO4·12H2O（MW 358.14） ?71.6g 蒸馏水????????????? 至1000ml 溶解后，高压灭菌，室温保存。 ? 10％SDS ? SDS????? ?10g 蒸馏水??? 至100ml 50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 ? 10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺? ?0.1g 超纯水?? ?1.0ml 溶解后，4℃保存，保存时间为1周。 ? 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) ??45.43g 超纯水 ???????????200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 ? 0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） Tris (MW121.14) ?15.14g 超纯水 ???????????200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 ? 40％Acr/Bic（37.5：1） 丙稀酰胺（Acr）???? ?37.5g 甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g 超纯水????????????? 至100ml 37℃下溶解后，4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。 ? 20％Tween20 Tween20???? ?20ml 蒸馏水?????? 至100ml 混匀后4℃保存。 ? （二）使用液 ? 单去污剂裂解液（50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100μg/ml PMSF）： 1mol/L Tris·HCl（pH8.0）?? ?2.5ml NaCl ????????????????????????0.438g TritonX－100 ????????????????0.5ml 蒸馏水?????????????????????? 至50ml ? 混匀后， 4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100μg/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。 ? 0.01mol/L PBS（ pH 7.2-7.4） 0.2 mol/L NaH2PO?????? 4 19ml 0.2 mol/L Na2HPO4????????????? ?81ml ? Na