生化课件蛋白质的结构与功能.ppt

* * * * 造成变性的因素： 如加热、乙醇等有机溶剂、强酸、强碱、重金属离子及生物碱试剂等 。 变性的本质：破坏非共价键和二硫键， 不改变蛋白质的一级结构。 变性的后果：溶解度降低，粘度增加，结晶能力 消失，生物活性丧失，易被蛋白酶水解。 应用举例 临床医学上，变性因素常被应用来消毒及灭菌。 此外, 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如疫苗等）的必要条件。 * 蛋白质沉淀： 蛋白质变性时会因空间结构被破坏而导致疏水侧链暴露出来，肽链相互缠绕继而融汇聚集而从溶液中析出，称为蛋白质沉淀。 变性的蛋白质易于沉淀但不一定沉淀；同样蛋白质发生沉淀，也不一定是因为变性引起。 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为变性蛋白质的复性(renaturation) 。 天然状态，有催化活性 尿素、 β-巯基乙醇 去除尿素、 β-巯基乙醇 非折叠状态，无活性 若蛋白质变性程度较轻，去除变性因素后，蛋白质仍可恢复或部分恢复其原有的构象和功能，称为变性蛋白质的复性(renaturation) 。 但许多蛋白质变性后，因空间结构破坏严重而难以复性，称为不可逆变性。 蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。 * 蛋白质的凝固作用(protein coagulation) （四）蛋白质的紫外吸收 由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。 （五）蛋白质的呈色反应 ⒈茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。 ⒉双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中的肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。 （五）蛋白质的呈色反应 ⒈茚三酮反应(ninhydrin reaction) 蛋白质经水解后产生的氨基酸也可发生茚三酮反应。 ⒉双缩脲反应(biuret reaction) 蛋白质和多肽分子中的肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈现紫色或红色，此反应称为双缩脲反应，双缩脲反应可用来检测蛋白质水解程度。 O H2N-C-NH2 = O H2N-C-NH2 = + O O H2N-C-NH-C-NH2 = = 第五节 蛋白质的分离纯化 The Separation and Purification of Protein （一）透析及超滤法 * 透析(dialysis) 利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。 * 超滤法 应用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。 （二）丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀 *丙酮和乙醇等有机溶剂极性强，故能破坏蛋白质表面的水化膜而使蛋白沉淀。 使用丙酮沉淀时，应在0～4℃低温下进行，丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离以免变性。 *盐析(salt precipitation)是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。 * 免疫沉淀法： 将某一纯化蛋白质作为抗原免疫动物，可获得抗该蛋白的特异抗体。利用特异抗体识别相应的抗原蛋白，并形成抗原抗体复合物的性质，可从蛋白质混合溶液中分离获得抗原蛋白。 （三）电泳 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳(elctrophoresis) 。 例：人血清中有各种蛋白质： 清蛋白（pI=4.64) α-球蛋白（ pI =5.06) α-球蛋白（ pI =5.06) β-球蛋白（ pI =5.12) γ-球蛋白（ pI =6.85 ~7.3) 2 1 如把上述各种蛋白质都处于有同一pH值（如=8.6)的溶液中，则由于它们的等电点不同，导致它们所带的电荷量也不等（但都带负电）。与8.6的差值越大，则所带的电荷量越多。如置入同一电场中电泳，它们都会向正极移动，但因速度有差别而分离开来。 醋酸纤维薄膜 + - 点样血清（包括各种蛋白） 正、负极和薄膜都和pH=8.6的缓冲液接触 + -