基因克隆的质粒载体校对版.doc

1.基因工程：是要按人们的意愿去有目的地改造，创建生物遗传性，因此最基本的工程就是得到目的基因或核酸序列的克隆。分离或改建的基因和核酸序列不能自身繁殖，需要载体携带它们到合适的细胞中复制和表现功能。 2.载体：英文单词Vector，在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。 3.理想中基因工程载体的特征：能在宿主细胞中复制繁殖，而且最好要有较高的自主复制能力；容易进入宿主细胞，而且进入效率要高；容易插入外源核酸片段，插入后不影响宿主细胞和其在细胞中的复制。要求载体DNA上要有合适的限制性核酸内切酶位点；容易从宿主细胞中分离纯化出来，便于重组操作；有容易被识别的筛选标志，便于克隆操作。 4.载体的种类：质粒（Plasmid）载体；入噬菌体；柯斯质粒（Cosmid）；M13噬菌体；杂交质粒；病毒载体，包括穿梭载体（Shuttle ）；细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome，BAC)；酵母人工染色体(yeast artificial chromosome，YAC)；来源于P1的细菌人工染色体（P1-derived artificial chromosome， PAC）；哺乳动物人工染色体（MAC，mamal artificial chromosome）；人类人工染色体（HAC，human artificial chromosome）；植物人工染色体(PAC) 5 Plasmid 质粒： 独立于细菌染色体外的双链环DNA分子。 1大肠杆菌的各个菌株中找到了不同类型的质粒，主要有三种类型的质粒：F质粒、R质粒和Col质粒。 2.F质粒 F因子或性质粒，能使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在的该质粒受体细胞中。 3.R质粒 通称抗药性因子，可编码一种或数种抗菌素抗性基因，并可将这种抗性转移到缺乏该质粒的适宜受体细胞中，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。 4.Col质粒 即产生大肠杆菌素因子，编码控制大肠杆菌素合成的基因，大肠杆菌素是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。 5.质粒的一般生物学特性 a细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成分。可以持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆的整合到寄主染色体上，随染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 b绝大多数质粒是环形双链的DNA组成的复制子。 c质粒DNA在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。也有线性质粒，酵母的杀伤质粒是一种RNA质粒。 d根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200个拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。 e质粒的不亲和性：两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。 6.环形双链质粒的三种构型：超螺旋构型（SC）共价闭合环状DNA；开环DNA构型（OC）单链缺口环状DNA；线性分子构型（LC）双链断裂DNA。 7.适于基因克隆载体的质粒DNA分子特征：复制基因（replicator）；选择性记号；克隆位点。 8.质粒DNA编码的表型 a质粒DNA仅占细胞染色体组的一小部分，一般约为1%～3%左右，但却编码一些重要的非染色体控制的遗传性状。 b质粒赋予寄主细菌的特性，包括：抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子，以及其他方面特征。 9.质粒DNA的转移 根据遗传分子特性，质粒可分为：结合型和非结合型质粒。 结合型质粒：即自我转移质粒，除去具有自主复制所必须的遗传信息之外，还有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。 非接合型质粒：不能自我转移的质粒。尽管具有自主复制的遗传信息，但失去了控制细胞配对和结合转移的基因，因此不能够从一个细胞自我转移到另一个质粒。（可用于基因克隆载体） 10.F质粒又叫F因子，即致育因子（fertility factor）的简称，是在某些大肠杆菌细胞中发现的一种最有代表性的单拷贝的接合型质粒。 F质粒有三种不同的存在方式： （i）F+细胞：以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，其上不带有任何来自寄主染色体的基因或DNA区段。（ii）F′细胞：以染色体外环形双链质粒DNA形式存在，同时在其上还携带着细菌的染色体基因或DN区段。（iii）Hfr细胞（高频重组细胞）：以线性DNA形式从不同位点整合到寄主染色体。 F因子是雄性决定因子，所以F+细胞又叫雄性细胞，与此相应的F-细胞则叫做雌性细胞。F+细胞的表面可以形成一种叫做性须（pilus）的结构，它促进雄性细