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动物细胞培养生物反应器及专用微载体 广州大学生命科学学院 柯德森 为什么要进行动物细胞培养? 动物细胞的特点、培养条件及存在问题 动物细胞培养方式 动物细胞培养的操作方式 动物细胞培养生物反应器 动物细胞反应器的控制 动物细胞培养专用微载体 动物细胞培养的意义 动物细胞培养对生产生物工程产品,特别是功能蛋白质方面具有明显的优势: 1)同源性: 直接进行翻译后加工,蛋白质可直接折叠成正确的构象 翻译后修饰糖基化，与天然产品一致。 2)有利于产品的分离纯化:分泌胞外、纯化方便 动物细胞培养的意义 医药卫生领域 生物工程生物制药领域 常用于生物工程及制药行业的动物细胞体系 W1-38：正常胚肺组织人二倍体 细胞系。 核型为2n=46。成纤维细胞， 能产生胶原，培养基用BME （Eagle’ Basal medium）。 10%小牛血清，pH7.2, 同工酶为G6PD B型。 倍增时间为24h， 有限寿命50代。 安全，用于制备疫苗。 MRC-5：从正常男性肺组织 中获得的人二倍体细胞系。 核型为2n=46。 属成纤维细胞。 培养基用加小牛血清。 同工酶G6PD B型。 有限寿命42～46代。增殖 速度较W1-38快，对不良 环境敏感性较W1-38低。 对人的病毒敏感。 用于生产疫苗。 BHK-21:从5只无性别的生长1天的地鼠幼鼠肾脏中分离的;成纤维样细胞,核型为2n=44;培养基为DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，现已用于工程细胞构建。 Vero：从正常成年非洲绿猴 肾脏分离的。 为贴壁依赖的成纤维细胞， 核型2n=60； 培养基为199培养基， 加5%胎牛血清；用于增殖病毒， 包括多瘤病毒、脊髓灰质炎、 狂犬病毒。 Namalwa：从肯尼亚患有淋巴瘤病 人获取，建成的人的类淋巴母细胞。2.8%的高倍体率，12～14条标记染 色体。单条X，无Y。培养基为RPMI 1640，添加7%胎牛血清。用于生产 α干扰素。 SP2/0-Ag14：通过融合的方法， 从有羊抗红细胞活性的BALB/c 小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系 P3X63Ag8融合杂交瘤SP2/NL-Ag 亚克隆中分离获得， 能耐受8氮鸟嘌呤 20μg/ml但 在含HAT 选择培养基中不能存活。 通常用培养基为DMEM，添加10%胎 牛血清。用于生产单抗杂交瘤细胞 和抗体。 Sf-9 1983年从亲代IPLB—SF21AE 中克隆形成。亲代细胞从秋粘虫的 蛹卵组织中分离获得。它对苜宿尺 蠖核型多角体病毒和其它杆状病毒 高度敏感。 通常用的培养基为Grace培养基， 添加3.3g/L 水解乳蛋白和3.3g/L 酵母浸液, 10%胎牛血清。用于高 效表达外来蛋白制品。 动物细胞的生理特点 动物细胞有两种类型: 动物细胞对周围环境十分 敏感: 对理化因素敏感，如： 渗透压、pH、离子浓度、剪切 力、微量元素等。 动物细胞对培养基要求高: 必需氨基酸、维生素、无机盐、 微量元素、葡萄糖、细胞生 长因子、贴壁因子等。 1、培养基组成：血清是目前细胞培养基中不可缺少的成分，向细胞提供生长所需要的激素、转移蛋白和其他营养成分，已成为细胞培养达到最优化和降低成本的主要障碍。 降低血清用量和采用无细胞培养基是目前研究的热点。 血清培养基的主要缺点及其原因： 血清中含有细胞生长必须的微量组分，但这些组分的成分及其作用至今未清楚，因此无法取代； 血清的存在是产物纯化的主要障碍； 血清是病毒污染及其他未知因素影响的主要来源，增加了细胞培养产品潜在的使用危险； 血清是培养基成本的主要部分； 血清同时也有生长抑制的作用； 血清使用使实验和生产过程标准化变得困难。 2、限制细胞生长的因素： 动物细胞培养系统能达到的细胞密度较低的主要原因是培养条件和最优化控制的困难，包括： 细胞代谢产物的毒害：乳酸、氨等； 营养物的耗竭 可利用的表面积的限制； 接种的细胞最小密度； 解决问题的方法是通过过程调控来实现：灌注系统、换液、流加等，其中灌注是最好的方法。同时采用合理的培养系统以增加表面积并提供最佳的物理化学环境。 3、污染的控制：污染来源包括细胞种子、血清、试剂、实验环境和操作人员。 污染控制起始于细胞种子及其保存； 除菌方法的改进是关键---血清？可高温灭菌的培养基的研究； 设备的合理设计及操作人员的培训必不可少。 4、产物表达的控制： 问题：细胞生长的最优化条件并不一定是表达的产物的最优化条件？ 问题的解决在于上游分子生