1.0第一章 核酸.ppt

第一章 核酸化学 20世纪80年代以来，发现许多特殊的RNA，功能涉及细胞的各个方面。300个核苷酸左右，统称为小RNA（small RNA，sRNA）。 推测：人类有1/3的基因由小分子RNA调控。 一个新层次上的基因表达调控方式。 小分子 RNA RNA干扰（RNA interference，RNAi） 2002年度，十大科学成就 双链RNA分子对基因表达的阻断作用，双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为siRNA siRNA结合到内源性mRNA编码区的某段同源序列上，导致该mRNA发生特异性的降解，导致基因表达的沉默。 疾病治疗：针对病毒、细菌的致病基因序列设计 siRNA。潜力巨大，路途遥远。 Micro RNA 21~23个核苷酸的小分子单链RNA，前体：发夹结构的70~90个核苷酸的单链RNA。 普遍存在于真核细胞中，可能属于直向同源物（ortholog）家族。 不同组织、不同发育阶段表达水平不同。 参与基因的表达调控。与mRNA非编码区中特定的互补位点结合来调节蛋白编码基因的表达。 推断人类基因组有至少800个microRNA,平均每个microRNA调节人类的200种不同的mRNA，并且多个microRNA能够协调它们的活动以调节一些特殊的靶标基因。他们还发现20％到30％的脊椎动物基因可能由microRNA调节。 六、核酸酶类 统称工具酶，包括核酸水解酶、合成酶、连接酶等 。 1970年 H.O.Smith 分离纯化得到第一个限制性内切酶 1972年 P.Berg 将外源DNA重组到猴病毒SV40中 1973年 S.Cohen 得到细菌的重组质粒 1975年 F.Sanger DNA的酶法测序 （一）核酸水解酶的分类 1．底物： 核糖核酸酶（ ribonuclease, RNase ） 脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease, DNase ） 2．作用方式： 核酸内切酶（endonuclease） 核酸外切酶（exonuclease） 3．按磷酸二酯键断裂的方式 4．其它：如双链酶、单链酶等 限制性内切酶 又称限制酶，主要降解外源的未经特殊修饰的DNA，对自身起保护作用。 特征： ①具有严格的碱基专一性，有专一的识别顺序、切点 ②切割会形成2种末端：粘性未端，平整末端 平整末端 粘性末端 连接反应 七、核酸的性质和最常用的研究方法 （一）一般性质 分子大小： DNA ：106～1010 RNA ：104～106 性状： DNA：白色纤维状固体 RNA：白色粉末 溶解度：DNA和RNA均不溶于一般的有机溶剂，微溶于水，但它们的钠盐在水中溶解度较大。 （二）粘度 （三）酸碱性质：两性离子，具有等电点 （四）紫外吸收 核酸中碱基的共轭双键，在紫外区有强列吸收，最大吸收峰在260nm附近，利用这一特性可进行核酸的定量测定。 根据A260/A280的比值------判断核酸样品的纯度 纯DNA：A260/A280=1.8 纯RNA：A260/A280=2.0 （若样品中含有杂蛋白或苯酚，则A260/A280比值明显降低） 纯的核酸样品------根据260nm的光吸收值计算含量 260nm光吸收值为1，相当于50μg/ml双螺旋DNA 或相当于40μg/ml单链DNA或RNA 或相当于20μg/ml寡核苷酸。 （五）沉降特性 1．核酸浮力密度的测定 氯化绝（CsCl）密度梯度沉降平衡 2．DNA中G-C含量的测定 G-C对的含量与浮力密度之间呈正比关系。 ρ=0.100（G-C%）+1.658(g/cm3) 3．核酸的构象和分离 ρ：RNA环状DNA线状DNA蛋白质 （六）核酸的变性、复性和杂交 1．变性 核酸分子氢键被破坏，高级结构破坏，理化性质和生物功能发生变化。 （1）热变性 结构：螺旋→线团 理化性质：紫外吸收↑粘度↓浮力密度↑ 生物活性：生物活性↓或丧失 （2）熔点（Tm）:熔点，熔解温度，变性温度，解链温度 加热变性，DNA双螺旋结构失去一半时的温度。 82～95 ℃ （3）影响Tm值的因素 ① DNA的均一性 均质DNA，熔解过程发生在一个较小的温度范围之内。 ② DNA中G-C对的含量 经验式（G-C）%=（Tm-69.3）×2.44 ③ 离子强度 越低，Tm越低，温度范围较宽。 2．复性 （1）复性 理化性质：比旋光度↑粘度↑ 生物活性：部分恢复 （2）影响复性的因素 样品的性质：GC含量、均一性等 DNA的浓度：越大，越快 DNA片段的大小：越大，