胚胎工程---克隆.doc

动物克隆的理论及进展 F0515002 5051109091 张杰群 胚胎发育过程是核质之间、细胞与细胞及细胞与胞外基质按严格的时空秩序相互作用的结果。从全能或多能胚胎干细胞分化为具有独特功能的体细胞，完全取决于基因在时间与地点上的选择性表达。对细胞分化和发育来说，最重要的不是个别基因的表达，而是整个基因网络在时间和空间上的紧密联系和配合。组成包括人体在内的高等动物机体的亿万个细胞，都是由一个受精卵发育而来的。像胚胎干细胞一样，分化了的体细胞仍然具有一整套完整的遗传信息。过去人们认为，细胞的分化程度越高，它指导早期胚胎发育成新个体的能力就越低，高度分化的体细胞甚至完全不具备这种能力。近几年体细胞动物克隆技术上取得的突破，不仅给人们的观念带来了很大的改变，而且由于它所蕴藏的商业和社会价值，在全世界引起了轰动。1. 动物克隆的理论基础在许多人眼里，体细胞克隆羊多莉 (Dolly) 的诞生是克隆技术的开始。其实不然。“克隆 (clone)”一词来源于希腊语，原意是用于扦插的枝条，也就是指无性繁殖。克隆在植物界的应用已有上千年的历史，理论上的突破则是本世纪的事。1902 年德国植物学家 Haberlandt指出，植物的体细胞具有母体全部的遗传信息，并具有发育成为完整个体的潜能，因而每个植物细胞都可像胚胎细胞那样，经离体培养再生成为完整植株。这就是所谓的细胞全能性。许多科学家为证实植物细胞的全能性作出了不懈的努力。1958 年，Steward成功地将一个胡萝卜细胞试管培养，长成了一株具有根、茎、叶等器官的完整植株。1964年Guha 和 Maheshwari利用毛叶曼陀罗的花药培育出单倍体植株。这样，植物细胞全能性获得了充分的论证。建立在此基础上的组织培养技术也得到迅速发展。 与植物细胞不同，在动物发育过程中分化了的细胞不能再产生完整的充分分化的个体。然而，动物胚胎的生长、分化和发育是否造成体细胞基因组的不可逆性修饰，即在发育过程中分化了的细胞是否具有与受精卵相同的核等价性 (nuclear equivalency) 或基因组连续性，一直是发育生物学要解决的问题。早在30 年代，著名的胚胎学家 Spemann 就已经提出“分化了的细胞核移入卵子中能否指导胚胎发育”这样的设想。用两栖类动物进行的一些克隆实验表明，早期胚胎细胞核经移植可产生成熟的动物个体，而从蝌蚪及成体动物细胞中取出的细胞核经移植生成的克隆动物最晚只能发育至蝌蚪期。胚胎分割及胚胎细胞核移植克隆动物已在许多物种中获得了成功。体细胞克隆绵羊、小鼠、牛及山羊的成功，证明高度分化的细胞核仍具有全能性。2. 体细胞克隆羊及小鼠实验成功分析 克隆羊Dolly 是世界上第一只由成体细胞通过无性过程产生的哺乳动物。在Dolly 诞生后的一年多时间里，全世界掀起了一股克隆热，并引起了一些激烈的争论和对Dolly身份的质疑。1998 年7 月出版的《Nature》报道两个独立的研究小组分别对Dolly 的血样、供体母羊冷冻组织及其细胞培养物进行卫星DNA 分析和DNA指纹分析，确认三者的一致性，证明Dolly 确实是体细胞克隆动物。在同期《Nature》上，美国夏威夷大学Wakayama 等人报道，由小鼠卵丘细胞 (cumulus cells) 克隆了27 只存活小鼠，其中7只是由克隆小鼠再次克隆的后代。 两栖类和哺乳类核移植实验发现，经核移植的卵母细胞不能正常发育的一个关键问题是供体核和受体卵母细胞之间的细胞周期不相容性。Wilmut 等的成功之处就在于他们找到了一种使供体核和受体卵母细胞更相容的方法。他们通过血清饥饿法使供体核细胞处于二倍体的G0 期，这样处理的供体核在DNA复制的时间上就与处于中期II的受体卵母细胞同步。从建立正确的染色体倍性这个角度来看，供体核处于G1 期也可以获得克隆动物。稳定表达b -半乳糖苷酶-新霉素基因的胎儿成纤维细胞作核供体，获得克隆牛证明了这一点。 人们一般认为，供体核和卵母细胞组成的重组胚胎的发育过程与正常状况受精卵相仿。 羊胚胎基因组的转录一直到8～16个细胞才开始，这种转录时间的差异在理论上将允许胚胎有充裕的时间对植入的成体羊细胞核进行重新编程，使其进入胚胎发育期。由于不同的物种胚胎转录的起始时间各异，所以克隆的难易也不同。以往的研究发现，在小鼠的克隆过程中，基因组很早就被激活，移植的细胞核没有足够的时间进行重新编程。因此，许多研究者认为小鼠是最难克隆的动物之一。 Wakayama 等人的工作改变了这种观点。与Wilmut 等的方法相比，Wakayama 等采用了一种新的、相对简单的克隆技术。Dolly 是采用母羊的乳腺组织细胞经过“饥饿“ 培养，与去核的卵细胞进行电融合，促使融合细胞中遗传物质的重编程 (reprogramm