EBV与细胞永生化__培训课件.ppt

20.4.1 对B细胞的激活和转化作用 EB病毒一旦附着于B细胞表面,即可引起后者激活,并产生一系列的生物效应:受染细胞从细胞周期的G0进入G1期,还伴有细胞编码的B细胞活化抗原(诸如CD23和白细胞移动抑制因子等)的合成和释放?这种由病毒附着所引起的初期激活作用产生迅速,且用在体外被灭活的病毒颗粒也可产生同样效应? 在初期激活作用的基础上,随着病毒颗粒穿入细胞内?以之起潜伏感染,细胞的活化进一步加剧,引起细胞的RNA合成?抗体分泌?DNA复制和细胞分裂?EB病毒引起的细胞活化和通常在体外使用的B细胞活化剂引起的细胞活化不同,其区别在于后者只起一种暂时的作用,而EB病毒引起的细胞活化则导致细胞无休止地增生,转化为永生的类淋巴母细胞株?EB病毒感染建株的类淋巴母细胞尽管是永生细胞,但接种裸鼠皮下后,并不产生肿瘤,这是此类细胞与大多数直接从BL组织中建株的类淋巴细胞在生物学特性上的主要区别? 20.4.2 与转化功能有关的病毒基因 寻找与 EB病毒细胞转化功能有关的基因,主要依靠病毒遗传重组实验的途径?随着实验技术的发展,这方面的研究经历了3个阶段的发展:①回复突变重组:病毒株P3HRl产生的病毒颗粒无转化细胞能力,对其基因组的分析发现NA2区域有较大缺失:将该病毒株和该区域基因组完整的其他病毒株重组,得到的具有转化能力的重组株一概具有完整的NA2基因?此后用单个NA2基因和P3HR1重组,亦成功获得了能转化细胞的回复突变株,由此进一步证实了NA2在转化细胞中的重要作用?它亦是第1个被实验方法确认的转化细胞的必需基因?②定向基因缺失突变株：该方法利用同源重组的原理,将一选择基因(如新霉素耐药基因)取代病毒基因组的某一特定基因(靶基因),经筛选后便得到定向基因突变株?Kieff和Sugden分别领导的两个实验室在这方面作了大量工作,先后确定了6个NA中的5个(即除NA5之外),和膜抗原1为6个转化功能的必需基因?⑧建立“微型”EB病毒:为了证实其他病毒基因的存在与否并不影响病毒的细胞转化功能及研究6个转比必需基因的相互关系,Kieff的实验室成功地用由3个噬菌体携带的病毒基因组片段重组成具有转化细胞能力的Mini EB病毒?综合上述实验,EB病毒基因组与细胞转化有关的片段总长度为64kb? ? 20.4.3 LCLs与细胞永生化机制研究 目前这方面的研究尚处于起步阶段,但正日益受到重视?总之概括起来,有以下三方面的研究? 20.4.3.1 LCLs与 p53及细胞周期调控相关基因 20.4.3.2 LCLs与端粒酶活性 20.4.3.3 LCLs与异常核型 20.4.3.1 LCLs与 p53及细胞周期调控相关基因 众所周知,p53作为一种抑癌基因,能够阻滞细胞周期的G1/G0 期,使细胞不能进入 S期,从而抑制细胞无限制的分裂增殖,诱导那些DNA损伤的细胞发生凋亡?在EBV使B淋巴细胞永生化形成LCLs的过程中,病毒对于细胞分裂和凋亡的永久性调控是必需的,而这种功能在许多正常细胞中是由 p53执行的,所以人们开始关注EBV感染和转化的早期阶段 EBV基因和 p53之间的关系?有趣的是,Chen等经试验证明,EBV感染静止期B细胞后提高了细胞p53的转录水平?这种p53水平的提高大约始于感染后2 4小时,这一时间比EBV诱导的细胞DNA合成至少早 2 4小时; p53水平在感染后4~ 5天达到最高 (大约是静止期 B细胞的 1 0倍 );此后,缓慢的降低,然后保持某一水平至少 5个月?EBV能够克服正常的细胞调控机制而导致细胞的永生化生长,阻止细胞的正常死亡,而这些调控机制中的一些是 p53依赖性的?研究表明,p53的诱导并不是通过EBV结合于细胞表面的CD2 1而触发的细胞内信号传递途径完成的?p53水平提高的时间提示EBNA2和LMP1可能与此过程有关,因EBNA2在EBV感染后12~ 24小时开始可以检测到,而LMP1水平的峰值出现于感染后4~ 6 天。 事实也的确如此,有试验证明,EBNA2和LMP1分别通过激活转录因子NF-κB独立的介导了EBV感染后细胞内p53水平的增高?但为什么p53的表达水平上调了细胞还会永生化呢? Chen认为原因可能有以下几个方面: ① p53可能要达到一个阈值才起作用,而EBV感染期间没有达到此阈值; ② p53介导的细胞周期中断或细胞凋亡的下游事件可能被 EBV潜伏蛋白或EBV诱导的细胞蛋白所阻断; ③ EBV诱导的c-myc和其他细胞周期调控蛋白(比如细胞周期蛋白D2,cdc-2,细胞周期蛋白E)水平的增高可能阻断了高表达的p53和p21/WAF1的抑制作用,从而不断