华理分子生物学实验要素.doc

曲霉脂肪酶编码基因的克隆与表达分析 接入载体为pET-28a，外源基因为AFL-1，PCR产物直接酶切（NdeI/BamHI）后纯化连接pET28a 外源基因信息：/gene/?term=3504452 AFL1-1（Gene ID=3504452）序列信息统计如下： 1 atggcttctc caattctgcg atcaccgatt acttcggacc tcgccaacgt aacacccgat 61 ttggtggatg ttagcactcc cgaaaaattg aaatcctacc gcgaatcact tgaaccaatc 121 ttcactttgg agaatatcat ccgagggaaa gagaacatca tctcctacga ggaactggac 181 atcccaggcc ccgcaggacc gatgcgggcc accatcttcc gccccaagca ccaaacccac 241 cctatcgatg aaatccctgg tatcctacac atccacggcg ggggcctcgc cacgggaaac 301 cgcttcctgg gcttcaccat gctcgactgg gtcgagtccc tcggtgccgt ctgcctgacg 361 gccgagtacc gtctcgcccc ggaacatcac cagcccgccc agctggaaga cagctacgcc 421 gcgctgcagt ggatgagcga ccacgccgcc gagctgggct tcaacccgcg caagctggtt 481 gtctgcggta gctcggcggg gggcaatctc acggcggggg tcaccttact cgcgcgggac 541 cgctcgggcc cgcaaatccg cggccaggtg ttgatctatc cgtgggttga cgatggcatg 601 gactacgtgt ccatgcggca gtatgcggat attgcgcctg tgagggacgt ggacgccgcc 661 gtgttggcta attatgcgtt tggcgagagg cgcgagcacg cggatatgta tactgtgccg 721 atgcgcgcga cgaatttcgc gggcttgccc ccgacgttta tcgatgtggg tgaggcggat 781 gtgtttcgtg atcaggatat cgcgtacgcg tcggctttgt ggaaggatgg tgtctcgact 841 gagttgcatc tgtggccggg cagttggcat gggtttgatg tctttgttcc tgatgctccc 901 attagtcggc gggcgagggc tgctcggttg gaatggcttc ggaagttgtt aagtgtgcct 外源基因PCR扩增引物序列： P1: 5’GCGCGGCAGC CAT ATG GCT TCT CCA ATT CTG CGA 3’ P2: 5’GCTCGAATTC GGA TCC AGG CAC ACT TAA CAA CTT CCG AAG 3’ N端保留了标签，用于亲和层析 实验流程安排 第一天 外源基因的制备 涉及实验：PCR、酶切、电泳、回收 掌握实验原理：PCR及基本要素和注意点、酶切、电泳、回收 实验顺序：PCR扩增--电泳--纯化--酶切--电泳--割胶及回收--载体接种 进度限制点：PCR为统一开机，需要所有同学完成后进行 上交样品：外源基因回收样品，标记好组号 外源基因的PCR制备体系 1# 2# 总体积 50?l 50?l ddH2O 35?l 34?l 10×buffer 5?l 5?l dNTP（2.5mM） 4?l 4?l P1（5pmol/?l） 2?l 2?l P2（5pmol/?l） 2?l 2?l 模板DNA 1?l 2?l Taq酶（5U/?l） 0.25?l 0.5?l PCR反应条件：退火温度61度30s，延伸时间1min。 预变性：95度，5min， 变性95度，30s， 退火61度，30s， 延伸72度，1min， 30循环。 延伸