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用聚合酶链反应方法自动测序DNA 聚合酶链反应（PCR），为一种通过制备DNA模板来进行测序被用于的反应。原位程序直接测序PCR的产物通过双脱氧终止法是使用荧光团标记的测序引物发展的。合并序列反应液后，装入单个含有荧光的电泳泳道的序列分析仪中。DNA的目标缺乏一个在通用标记测序引物中掺入一个通用初级序列到PCR产物中的初级序列。用这种方法，λ噬菌体的基因组区域中一个351个碱基对的序列在电泳通道中的准确性 99％。长1700个碱基对的未知序列，通过此过程测序，“PCR基因扩增”的策略相结合。1110个碱基组成的两条链的重叠区域只有两个单碱基发生错配。可以用自动化的DNA序列高度多态性HLA-DQA-1（阿尔法）在人类基因组区域执行这种简单的方法进行分析。分离提取个人在一个月时的血液样本中的DNA，使用该PCR测序方法来模拟以明确基因型。 DNA出现双脱氧终止法的测序（1）鼓励科学家设计出合理策略，以应对大型测序项目。（2）显然，对于未来，AU-缩混高通量方法的开发是一个合理的焦点。为了实现这一目标，自动DNA序列分析已经通过组合基于荧光的检测用脱氧终止实现。（3）其他方面克隆测序项目，制备模板和测序运行重新动作。然而，复杂的人工操作还需要劳动力和技能。此外，操作类型需要为这些手工方法的模板的类型，因此，缺乏重复性性质有利于自动化操作。 聚合酶链反应（PCR），在体外DNA上午plification方案（4）。已经被提出作为一种技术来制备自动DNA测序前模板（5,6）。之前自动化PCR过程一直是半自动化很大程度上是凭借其周期性，包括（a）变性。 PCR过程一直半自动化很大程度上是由凭借其周期性，组成的DNA模板（95°C）所示，核糖核酸引物（b）杂交引物变性的模板（50°C）中，（c）模板的复制（70°C）催化Thermu.s水生的DNA聚合酶（Taq聚合酶）。在PCR技术中我们已结合DNA模板制备与用于自动DNA序列分析的基于荧光的方法（3,7）的DNA测序项目的多级自动更充分。 材料和方法 仪器与试剂 对于热循环我们使用DNA热循环仪 （Perkin-Elmer公司，康涅狄格州Norwalk06859），一般根据以下循环：50℃2分钟，70℃2分钟20秒，和94℃，1分钟。用于DNA扩增，我们只用DNA扩增试剂盒的“基因扩增”生化试剂，其中包括10×缓冲液，脱氧核苷三磷酸，和从水生生物中提取的Taq聚合酶（Perkin-Elmer公司中分离鲸鱼座，诺瓦克，CT06859）。轻质矿物油是从Sigma公司（圣路易斯，密苏里州63178追逐;cat.no. N-23516）购买;0.5毫升无菌管从罗宾斯科学购买（山景，CA 94043）。 基于荧光的DNA序列分析是用370A DNA测序仪（生命科技公司，福斯特城，加利福尼亚州94404]，装配有6％的聚丙烯酰胺凝胶，并与制造商的运行1.3版本软件。聚丙烯酰胺凝胶制备的玻璃板从ABI购买。修改的T-DNA 7聚聚合酶（“测序酶”第1版，目录号0700）和终全国核苷酸混合物（cat。NO70714，70716，70718，70720）从美国购买（克利夫兰，OH 44122）。测序酶（20单位）稀释在含有50mmol二硫苏糖醇的，3.8mmol水中，和0.38毫摩尔/l的EDTA。冻干序列引物（-21 M13和M13反向，标有四个荧光，FAM，ROX，JOE和TMRA）为从ABI购买（8）。每个荧光标记通过将引物溶于10mmo1 / L的Tris缓冲液（pH8.0）中，含有1.0mmol/ml的EDTA，得到0.8pmol/l的终浓度，并是在—20保存。 从全血浆提取DNA使用ABI340A核酸提取（根据ABI用户公告。14，十月，1987）。人类DNA的1.7 kb的片段克隆到pGEM捐赠勿博士克雷格·文特尔（NA-卫生，贝塞斯达，MD20892 tional研究院）。??我们合成脱氧寡核苷酸勿将phosphora-midite方法（9），用381A DNA合成仪（ABN0.2}，摩尔规模（0.2皮摩尔周期，vereion1.23软件;ABI用户公告没有。 7，八月，1986）与（2-O-氰基乙基）-phosphoramidites（ABN。寡核苷酸的纯化化墨盒从ABI购买。 ?紫外吸收光谱，我们使用一个8451A二极管阵列分光光度计（惠普，帕洛阿奥拓，CA94304）。 程序 ?? 制备PCR引物，溶于氨水在57℃孵化20小时，有一半的引物（1.5毫升中NHG）通过寡核苷酸净化筒富集如别处所述（10）。（图1：101-109，L11,112，和114），制备蒸发至干的富集产物，收集溶解在1mL去离子水