血液病标准化方案__培训课件.ppt

T-B淋巴细胞白血病 FITC PE PC7 PC5 TUBE1 CD22 CD20 CD45 CD19 TUBE2 FMc7 CD23 CD45 CD2 TUBE3 CD7 CD10 CD45 CD5 TUBE4 CD16 CD8 CD45 CD4 TUBE5 CD57 CD56 CD45 CD3 TUBE6 Kappa Lambda CD45 sIgM B淋巴瘤残留病(B-MRD) FITC PE PC7 PC5 TUBE1 CD38 CD34 CD45-APC CD19 TUBE2 CD38 CD10 CD20-APC CD19 TUBE3 CD38 CD13+33 CD45 CD19 霍奇金淋巴瘤 FITC PE PC7 PC5 TUBE1 CD34 CD117 CD45 CD19 TUBE2 CD15 CD13 CD45 CD33 TUBE3 CD22 CD10 CD45 CD20 TUBE4 CD7 CD2 CD45 CD5 TUBE5 CD4 CD8 CD45 CD3 TUBE6 CD36 GlyA TUBE7 CD30 CD45 CD38 TUBE8 CD79a 标准化方案 方案设计 标本处理 标本检测 结果分析 标本的准备 （一）外周血、采集物或骨髓 1.保存方法:抗凝管室温保存，12小时内处理标本，大于24小时，肝素抗凝4℃冰箱保存 2.处理方法：无需特殊处理 3.抗凝剂的选择：血液标本可用EDTA或肝素；骨髓标本用肝素！ （二）体 液 1.保存方法：肝素抗凝管室温保存12小时内完成检测；储存在4℃冰箱时间应48小时。 2.处理方法：新鲜标本1000rpm离心5min,弃上清后，加入PBS离心洗涤5min，加入适量PBS，必要时300尼龙网过滤后备用 （三）组织细胞 1.保存方法：新鲜组织标本置于生理盐水或PBS中12小时内处理完标本。若4℃冰箱保存应小于48小时。 2.处理方法：机械法处理组织标本！ 荧光染色： （1）细胞表面抗原标记： 1）根据实验方案（4色方案）加入4种荧光素（FITC、PE、PC7、PC5或APC)标记的相应抗体。 2）标记：加入待检标本适量与检测管；低速涡旋混匀室温避光15min。 3）溶血：加入Oplise C 溶血素0.5ml,震荡混匀，室温避光10min。 4）洗涤：加入PBS适量（3ml左右）避光室温放置10min后1000rpm 5min ； 5)弃上清液，加适量PBS（0.2~0.5ml) 混匀后上机检测，不能及时检测者置4℃冰箱内保持；24小时内完成检测。 （2）细胞膜和胞内抗原同时标记 1）膜表面抗原染色：分别加入相应的荧光素标记抗体和适量骨髓标本，充分混匀后室温避光孵育15min； 2）加入贝克曼破膜剂1液100ul混匀后室温避光放置15min； 3）洗涤：加入PBS 1200rpm 离心洗涤5min 4)加入破膜剂2液混匀后室温避光5min 5）加入胞内抗体（如MPO cCD79a cCD3等）充分混匀室温避光15min; 6)洗涤：加适量PBS 1200rpm 5min 离心洗涤！ 7）上机检测：弃去上清；加入适量PBS（200~500ul）混匀上机检测；不能及时检测则4℃冰箱保存，24小时内完成检测。 标准化方案 方案设计 标本处理 标本检测 结果分析 开机：启动FC500仪器； 质控：选择质控程序，执行flow check； 上样：根据实验项目选择相应方案模板，输入相关信息；后MCL自动上样！ 部分标本颗粒过多（如MRD)，需先200目过滤后再上机检测！ 检测过程中需要FSC /SSC门内细胞分布；若细胞分群不够清楚，需及时调整电压！ 标准化方案 方案设计 标本处理 标本检测 结果分析 免疫分型设门、分析和报告 设门：选择感兴趣的细胞分析其各参数表现常用设门方法如下： 散射光（FSC/SSC)设门 散射光和荧光设门 CD45/SSC 设门 CD19/SSC 或CD19/CD45设门 m/cCD3/SSC或CD3/CD45 设门 CD45/CD38或CD38/CD138设门 FSC/SSC 设门：根据FSC反应细胞大小，SSC反应细胞结构的原理；通过FSC/SSC二维点图将细胞初步分群：淋巴、单核、粒细胞；但是各区细胞有重叠，难以达到清晰分群的目的！主要初步设门！白血病的设门更多借助SSC/CD45设门法！ CD45/SSC辅助设门的原理 CD45是所有白细胞的抗原， CD45表达量在成熟淋巴细胞最高，单核细胞、粒细胞、早期造血细胞依次减弱。红细胞(中、晚幼红细胞、成熟红细胞)不表达 CD45。侧向角光散射(SSC)反映细胞的颗粒性，成熟粒细胞 SSC最高，依次为单核细胞、淋巴细胞、 早期造血细胞、红细胞。以 CD45／SSC