碱性磷酸酶的分离纯化与性质研究.doc新.doc

碱性磷酸酶的分离纯化与性质研究 生物技术1101班 其曼古丽·麦麦提 201131301028 摘要：经过匀浆，正丁醇处理，凝胶过滤等步骤，从猪肝中部分纯化了碱性磷酸酶。以磷酸苯二钠为底物，测得该酶的最适 pH为10， 最适温度为37℃， Km = 1.6565。KH2PO4对酶的活性有不同程度的抑制作用。 关键词：猪肝，碱性磷酸酶，分离纯化，性质 碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,简称AKP) 是一种底物专一性较低的磷酸单酯酶，广泛存在于人体、动物、植物与微生物中，在生物体内直接参与了磷酸基团的转移和代谢过程【1】。它在脊椎动物的骨化过程中发挥了重要作用【1】。海洋中的甲壳动物锯缘青蟹体内的碱性磷酸酶是其赖以生长、生存的重要酶类之一，它对海水中钙质的吸收、磷酸钙的形成、甲壳素的形成与分泌都具有重要作用【2】。提纯的碱性磷酸酶可用于核酸研究、毒物学研究及医学研究【3】。由于有益于皮肤细胞的再生和新陈代谢，该酶还可添加到药用化妆品中【4】。为了满足生产实践上的需要，仅国内以猪肝为材料来分离纯化碱性磷酸酶并对其性质进行分析的研究工作即已有若干。 1.1 材料与方法 1.1.1 实验材料 新鲜的猪肝脏。 1.1.2试验仪器 玻璃匀浆器，离心机，加样抢，恒温水浴锅。 1.1.3试验试剂 0.5mol/L醋酸镁溶液；2，0.1mol/L醋酸钠；3，0.01mol醋酸镁-0.01mol/L醋酸钠溶液；4，Tris-HCl PH8.8缓冲液；5，正丁醇；6，丙醇；7，95%乙醇；8，0.04mol/L作用物底物；9，0.1mol/L碳酸盐缓冲液（PH 10.0）；10，碱性磷酸酶液；11，0.5mol/L NaOH溶液；12，0.3%-氨基安替比林；13，0.5mol/L铁氰化钾；14，基质液，15，0.2m甘氨酸；16，0.2NaOH； 1.1.4 试剂配制 0.5mol/L醋酸镁溶液：107.25g醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至1000ml。0.1mol醋酸钠溶液：8.2g醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000ml。0.01mol/L醋酸镁-0.01mol/L醋酸钠溶液：准确吸取20ml0.5mol/L醋酸镁溶液及100ml0.14mol/L醋酸钠溶液，混合后定容至1000。Tris-HCl PH8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷12.1g用蒸馏水溶解后定容至1000ml，即为0.1mol/LTris溶液。取100ml0.1mol/LTris溶液，加蒸馏水约780ml，再加0.1mol/L醋酸镁溶液，混合后用1%冰醋酸调PH为8.8，用蒸馏水定容至1000ml。0.04mol/L作用物液：称取10.16磷酸二甲苯二钠，用煮沸后冷却的蒸馏水溶解并稀释至1000ml，加4ml氯仿防腐，存于棕色瓶内，放于冰箱内保存。0.1mol/L碳酸盐缓冲液:取无水碳酸钠6.36及碳酸氢钠3.36，溶解于蒸馏水中，并稀释至1000ml。碱性磷酸酶液：取纯化的碱性磷酸酶5mg，用PH缓冲液配制成100ml，放置冰箱内保存。0.3%4-氨基安替比林：称取3g4氨基安替比林及碳酸氢钠42g，用蒸馏水溶解至1000ml。0.5%铁氰化钾：称取10g铁氰化钾及30g硼酸各溶于800ml蒸馏水中溶解后两液混合加水至2000ml。基质液：称取磷酸苯二钠.2H2O 6g，4-氨基安替比林3g，分别溶于煮沸冷却的蒸馏水中，两液混合并稀释至1000ml， 加4ml氯仿防腐。 1.2 试验方法 1.2.1 碱性磷酸酶的分离纯化 取新鲜猪肝20g剪成组织糜，加入0.1mol/L醋酸镁—0.1mol/L醋酸钠60ml，在电动匀浆器上匀浆。取32.5ml肝匀浆液与10ml的正丁醇混合，用玻璃棒充分搅拌3—5分钟后室温放置30分钟，然后用四层纱布过滤。在23.5ml的滤液中加入等量的冷丙酮（-10℃保存）混匀后3000转冰冻离心5分钟，离心后弃去上清液取沉淀，然后加入0.5mol/L醋酸镁20ml混匀，用量筒量取29.5ml悬液，加入96%乙醇12.9ml至30%， 3000转离心5分钟。离心后弃沉淀取上清液33.5ml，加96%乙醇27.9ml至65%， 3000转离心5分钟。将上清液弃去，在沉淀中加入0.1mol/L醋酸镁—0.1mol/L醋酸钠20ml溶解，再加入96%乙醇9.75ml至30%， 3000转离心5分钟，此次离心后弃沉淀取上清液29.5ml，加入96%乙醇24.5ml至60%， 3000转离心5分钟，离心后取沉淀，加入0.5mol/L醋酸镁15ml溶解，使溶液总体积为17.5ml，加入99.5%丙酮8.2ml至33%， 3000转离心5分钟，取上清液加入99.5%丙酮7.65ml至50%，30