碱性磷酸酶的分离纯化-袁野_2010.10.09.ppt

碱性磷酸酶(AKP)的分离纯化 有机溶剂沉淀 概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。 原理： （1）降低了溶质的介电常数，使溶质之间的静电引力增加，从而出现聚集现象，导致沉淀。 （2）由于有机溶剂的水合作用，降低了自由水的浓度，降低了亲水溶质表面水化层的厚度，降低了亲水性，导致脱水凝聚。 常用的有机溶剂沉析剂 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广； 特点： 介电常数小: 60%乙醇的介电常数是48 丙酮的介电常数是22 容易获取 有机溶剂沉析的特点 分辨率高； 溶剂容易分离，并可回收使用； 产品洁净； 容易使蛋白质等生物大分子失活； 应注意在低温下操作； 影响有机溶剂沉析的主要因素 温度：低温有利于防止溶质变性；有利于提高收率（溶解度下降）； 搅拌速度：散热 溶液pH值：原则是避免目标蛋白与杂质带有相反的电荷，防止共沉现象。（pI） 离子强度:离子强度低有利于沉析，0.01~0.05mol/L 样品浓度: 0.5~2% 稀：溶剂用量大，回收率低，但共沉淀作用小 浓：节省溶剂用量，共沉作用强，分辨率低 金属离子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+ 1.称取兔肝2g,剪碎后置于玻璃匀浆器中，加入0.01 M的醋酸镁及醋酸钠混合液4ml, 进行匀浆。转入离心管，并加2ml 0.01 M的醋酸镁及醋酸钠混合液清洗匀浆器，之后将之倒入离心管，与原来的匀浆液混合。记录体积a，取0.1ml作为A液于EP管，待测比活性用。 5. (1)于悬液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为30%（0.46体积），混匀后2000r/min 5min，转移上清于离心管，弃沉淀。 (2)上清液中缓慢加入冷95%乙醇使其终体积为60%（0.85体积），混匀后3000r/min 5min，弃上清，沉淀用3ml 0.5M Mg(AC)2溶解,记录体积c。取0.1ml作为C液于EP管,待测比活性用。 用于活性测定：用Tris-Mg(AC)2缓冲液将 A液稀释25倍、B液稀释10倍、 C液稀释5倍，D液不稀释。 用于含量测定：用Tris-Mg(AC)2缓冲液将 A液稀释50倍、B液稀释20倍、 C液稀释5倍，D液不稀释。 (二)碱性磷酸酶的活性测定 实验原理： AKP是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解磷酸基团。最适pH范围为8.8~10, 需要镁离子作为激活剂。 血清AKP主要来自肝，小部分来自骨骼。 酶的活性通常是在一定条件下（最适温度、最适的pH、必要的激动剂等），一定的时间内，测定该酶所催化的反应系统中底物的消耗量或产物的生成量来确定。 AKP纯化程度鉴定 AKP纯化程度用酶的比活性反映。 酶的比活性是指单位浓度的酶蛋白样品中的酶活性。 722S型分光光度计使用方法 开机预热15min以上（打开盖预热）。 转动波长选择钮，选用所需的波长。 将装有空白、标准、样品的比色杯放入比色杯架，使空白管对准光路。 按MODE 键选择trans模式。 打开样品室暗箱盖（光门自动关闭），按0%ADJ 键，即能自动进行机械零点的调整，数码显示为0.000。 盖好比色杯暗箱盖（光门自动开启），按100%ADJ 键，即能自动进行空白零点的调整，数码显示为100.0。（一次如有误差可再按一次） 按MODE 键选择吸光度测定模式（ABS灯亮），数码显示自动转换为吸光度值0.000。 拉动比色杯架的拉杆，使测定杯进入光路，从数码显示上即可读出样品的吸光度 比色完毕后，关上电源开关，取出比色杯，将比色杯暗箱盖好，清洗比色杯并晾干。 分光光度计必须放置在固定而且不受振动的仪器台上，不能随意搬动，严防振动，潮湿和强光直射。分光光度计内放有硅胶干燥袋，需定期更换。 开机预热15分钟，待仪器稳定以后再开始进行测定。每年需定期进行波长校准。 必须保证测试样品为澄清的溶液，肉眼看不出来的轻微浊度也能引起读数的严重误差，必要时可通过离心来去除微粒。检测细菌培养液的光吸收时例外。 从冰箱中取出的样品一定要恢复到室温后再进行检测，否则低温会使水蒸汽在比色皿表面凝结，引起读数持续漂移上升。 比色杯盛液量以达到杯容积2/3左右为宜。比色杯的外表面，则必须先用滤纸吸干，再用擦镜纸或绸布擦净，然后才能把比色杯放入比色杯槽内。移动比色杯槽要轻，以防溶液溅出，腐蚀机件。 不可用手拿比色杯的光学面，禁止用毛刷等物摩擦比色杯的光学面。用完比色杯后应立即用自来水冲洗，再用蒸馏水洗净，也可用甲醇冲洗。洗涤后应把比色杯倒置晾干或用滤纸条将水吸去，再用擦镜纸轻轻揩干。 一定要保证比色皿正确