HPLC方法开发-流动相的选择.ppt

HPLC方法开发 ——流动相的选择 1. 流动相的一般要求 流动相对样品具有一定的溶解能力 流动相具有一定惰性 流动相应不改变填料的任何性质 纯度高 流动相的黏度要尽量小 流动相的物化性质要与使用的检测器相适应 流动相沸点不要太低 应选用挥发性溶剂 流动相配置好后要进行过滤 流动相配制好后要进行脱气 2. 常用溶剂的重要性质 极性 黏度 沸点 紫外截止波长 常用溶剂参数表 Solvent Polarity Viscosity(cp20℃) Boiling Point(℃) UV CutOff(nm) Hexane(正己烷) 0.06 0.33 69 210 Carbontetrachloride(四氯化碳) 1.60 0.97 77 265 Toluene(甲苯) 2.40 0.59 111 285 Benzene(苯) 3.00 0.65 80 210 Methylenechloride(二氯甲烷) 3.40 0.44 40 245 n-propanol(异丙醇) 4.00 2.27 98 210 Tetrahydrofuran(四氢呋喃) 4.20 0.55 66 220 Ethanol(乙醇) 4.30 1.20 79 210 Chloroform(氯仿) 4.40 0.57 61 245 Acetone(丙酮) 5.40 0.32 57 330 Acetonitrile(乙腈) 6.20 0.37 82 190 Dimethylformamide(二甲基甲酰胺) 6.40 0.92 153 270 Methanol(甲醇) 6.60 0.60 65 205 Ethyleneglycol(乙二醇) 6.90 19.90 197 210 Dimethylsulfoxide(二甲亚砜) 7.20 2.24 189 260 Water 10.20 1.00 100 210 3. 过滤 溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。 色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。 仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。 4. 脱气 氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。 超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min。 在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术，在线脱气。 5. 溶剂过滤器的防护 溶剂的质量或污染以及藻类的生长会堵塞溶剂过滤器，从而影响泵的运行，尤其水溶液或磷酸盐缓冲液。以下几种方法可以有效防止溶剂瓶内溶剂过滤器的堵塞。 （1）严格执行溶剂过滤 （2）勿使用多日存放的蒸馏水及磷酸盐缓冲液 （3）避免使溶剂瓶暴露在直射阳光下，尽量使用琥珀色的溶剂瓶盛放水溶液或磷酸盐缓冲液。 堵塞后的处理法方法：将过滤头从组件中取下，在浓硝酸（35%）中浸泡1h，然后用蒸馏水冲洗干净。 6．流动相的贮存 流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯容器内，不要贮存在塑料容器中。 贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧及尘埃溶入流动相。 磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存超过规定的有效期。 容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。 7．HPLC实验用水 HPLC实验用水除满足药典对纯化水 一般要求外，还需要满足以下要求： 项目 指标 电阻率，MΩ·cm，25℃，最小 18.0 总有机碳（TOC)，mg/L，最大 0.5 微粒，μm滤器 0.22 HPLC级水增加紫外加吸收要求： 在1cm池中，用HPLC级水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度分别不得过0.01、0.01和0.05。 8. 等度洗脱 在反相色谱中，极性越强的溶剂洗脱能力越弱。 等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，组分极性有一定差别的样品，多用于含量测定。 优点：基线平稳，保留时间重现性好，对流动相纯度要求低。 缺点：较早洗脱出的色谱峰时分离度差，较晚洗脱出的色谱峰展宽理论塔板数低。 9. 梯度洗脱 梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和pH值等，用于分析组分数目多样品。 优点：