土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定试验方案.docx

土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定学院：生命科学学院班级：XXX班姓名/学号：1.实验目的与要求：了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用方法和技术；掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及方法；掌握微生物淀粉酶活力测定的原理及方法；培养自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力；对所学习过的微生物实验方法进行综合技能训练；从不同环境土壤样品中筛选出能产淀粉酶的芽孢杆菌，并分析比较各产淀粉酶菌株的产淀粉酶活力及总结各芽孢杆菌在土壤中的分布情况。2.实验原理2.1实验中通过80℃水浴20min预处理，杀死无芽孢菌体，筛选出芽孢杆菌；再用稀释涂布平板法对芽孢杆菌进行初步筛选；又通过分区划线法对初筛菌株进一步分离纯化；最后用选择性淀粉培养基进行筛选，得到纯培养的产淀粉的芽孢杆菌。最后并通过耐盐试验、明胶试验、糖发酵试验、VP试验、吲哚试验等多项生理生化实验对筛选出来的菌种进行鉴定。2.2淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称,是用于酿酒、食品、 医药、纺织、饲料等具有商业价值的重要酶类。目前,在饲料行业由于芽孢杆菌对动物独特的生物学效应,对于高产淀粉酶的芽胞杆菌在动物饲料上应用的研究取得一定进展。配合饲料中含有淀粉 、 蛋白质 、 脂肪、纤维素 、 半纤维素、果胶等多种营养成分,这些营养成分都是由生物多聚物组成,必须依靠水解酶类将其酶解,才能被动物肠道吸收 。在饲料中起作用的淀粉酶主要是 α -淀粉酶和糖化酶( 葡萄糖淀粉酶) ,α -淀粉酶是将大分子淀粉水解成中等和低分子物质,产生大量新的非还原性末端,有利于糖化酶进一步水解,糖化酶则将α -淀粉酶水解出的一些中、低分子产物 ,从非还原性末端开始,逐次切下一个个能被动物直接吸收利用的葡萄糖。以芽孢杆菌作为饲料添加剂,一方面芽孢杆菌产生淀粉酶促进饲料中含淀粉营养成分的降解,充分被动物吸收利用; 另一方面芽孢杆菌进入消化道能提高内源酶的活性。尤其在动物开始断奶时,因其体内淀粉酶等含量低,不能满足生长发育的需求,若不及时补充淀粉酶等,则会造成消化不良,影响生长发育。所以高产淀粉酶芽孢杆菌的选育已成为饲料行业的一个新突破点.3.实验材料、设备及方法3.1.土壤采样地点：体育馆外草地、生化楼楼下（挑取2个不同地点）采用五点采样法来采样，各个采样点均采取土样10g左右(每个土样共40g)。用已事先灭菌的取样铲，将各个采样点的表层5cm左右的土除去，取5-15cm处的土样40g，装入事先准准备好的三个塑料袋内扎好。给塑料袋编号并记录地点、土壤土质、植被名称、时间及其他环境条件，分别记做A土样、B土样。一般样品取回后应马上分离,以免致微生物死亡.3.2染色材料：通用：吸水纸、香柏油3.2.1单染色：无菌水、草酸铵结晶紫染液（或石炭酸复红染液）3.2.2革兰氏染色：无菌水、草酸铵结晶紫染液、路哥氏碘液、95%酒精、石炭酸复红染色液3.2.3芽孢染色：吸水纸、香柏油、无菌水、草酸铵结晶紫染液、路哥氏碘液、95%酒精、石炭酸复红染色液、5%孔雀绿3.3 培养皿的配方3.3.1高盐培养基（牛肉膏蛋白胨液体培养基）（盐浓度2%、5%、7%、10%）（耐盐试验）配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠3g、琼脂15g、蒸馏水1000ml、pH7.0~7.2（也可以用营养琼脂33g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2～7.4代替）3.3.2牛肉膏蛋白胨培养基（耐高温试验）（温度梯度为10、20、30、40、50、60、70℃）配方：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠3g、琼脂15g、蒸馏水1000ml、pH7.0~7.2（也可以用营养琼脂33g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1000 mL，pH 7.2～7.4 代 替）处理：灭菌1.05kg/cm^2,20~30min3.3.3糖发酵培养基（作糖酵解试验用）配方：蛋白胨2 g，NaCl 5 g，K2HPO4 0.2 g，1.6%溴麝香草酚蓝水溶液2 ml（或者1 %溴麝香草酚蓝水溶液3 ml），待试糖10 g或15g(葡萄糖10g,而乳糖或半乳糖15g)，自来水1000 ml，pH 7.2～7.4；3.3.4葡萄糖蛋白胨培养基（VP和MR试验）配方：蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，NaCl 5 g，自来水1000 ml，pH 7.2～7.4，处理：121℃ 灭菌20 min；3.3.5蛋白胨水培养基（吲哚实验）配方：蛋白胨10 g，NaCl 5 g，自来水1000 ml，pH 7.2～7.4处理：121℃ 灭菌20 min；3.3.6淀粉牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（淀粉水解试验）：配方：可溶性淀粉2g，牛肉膏3g,蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂15-20g，自来水1000ml，pH 7.2—7.4；（也可以用营养琼脂33g，可溶性淀粉2g，蒸馏水