DNA检测方法.doc

/view/b5dda4d676eeaeaad1f33020.html /med/data/jcyx/xbswx/201003/349167.html 现在对DNA残留定量的方法主要有三种：1、分子杂交技术检测残余DNA2、基于DNA结合蛋白的方法（Threshold??immunoassay）检测残余DNA3、实时定量PCR法检测残余DNA ? 分子杂交技术检测残余DNA的原理和方法 分子杂交分析的基本原理是基于DNA探针检测变性而且固定在硝酸纤维素膜上的宿主细胞DNA。这些探针可以不依赖宿主细胞DNA来制备，例如用随机引物制备探针。探针上标记酶﹑生物素﹑放射性同位素﹑地高辛（Dig）等。由于地高辛标记核酸探针，操作方便、灵敏度高，已标记的探针在4贮存可达两年之久，方便随时应用，所以现在常采用地高辛标记核酸探针，用光标记法将光敏Dig标记到探针上，制成光敏-Dig-核酸探针，再与固定在硝酸膜上的靶核酸进行靶DNA分子杂交，使之与抗Dig-碱性磷酸酶结合，最后可用不同的检测方式进行检测，发光检测和显色检测均可，灵敏度可达10pg以下（表?1??三种残余DNA检测方法的比较）。 ? 基于DNA结合蛋白的方法（Threshold??Immunoassay）检测残余DNA的原理和方法 Threshold??Immunoassay分析系统是基于两种DNA序列非特异性蛋白，单链DNA（ssDNA）结合蛋白（SSB）和抗ssDNA?的单抗。检测的基本过程是当生物素—DNA单链结合蛋白和尿素酶—抗ssDNA?的单抗与变性的宿主细胞DNA结合最终形成复合物，通过亲合素将此复合物连接到生物素—硝酸纤维素膜，在通过洗涤所有非特异性的被洗脱掉，最后放于有尿素溶液的读数仪，尿素酶催化尿素分解成NH3和CO2?导致PH值发生变化，读数仪根据PH值的变化换算成DNA的量，从而达到检测残余DNA含量的目的。 ? 实时定量PCR法检测残余DNA的原理和方法 荧光定量PCR是基于PCR扩增时，在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，产物的增加可以通过荧光信号指示，通过实时监控PCR体系中的荧光信号，对样本中初始模板进行定量分析。定量PCR可实时检测产物量，通过加入已知浓度的标准样品绘制标准曲线，然后根据待测样品在标准曲线中的位置推算初始模板的浓度，从而达到检测残余DNA含量的目的。 ? 三种检测残余DNA方法的比较 3种方法用来检测疫苗DNA残留都要对样品进行相应的处理，这对最终的结果的准确性至关重要。而杂交相对对样品DNA的损失小，而用Q-PCR需要提取样品的DNA，损失较大。在我们选择那种方法时我们要考虑它的稳定性，敏感性，成本等以至找到最佳的性价比的方法（表?1），从表1?我们不难发现使用分子杂交的方法是一种比较可行经济实用的方法，目前国内也主要是用此方法。 表?1??三种残余DNA检测方法的比较 Hybridization Threshold??Immunoassay Q-PCR 特异性 物种特异性 无特异性 序列特异性 检测的最小序列长度（bp） 50 600 150 抗干扰性和稳定性 ++ + + 所需时间（h） 48 6 2 敏感性（pg） 10 6 1 初期花费（$） 1200 40000 70000 ? DIG?High?Prime?DNA?Labeling?and?Detection?Starter?Kit?II试剂盒产品简介 产品中文名称：高效DNA地高辛标记和检测试剂盒II 罗氏应用科学部（Roche?Applied?Science）是最早致力于向用户提供非放射标记技术的公司之一，让更多的科研工作者们可以避免使用危险的放射性同位素。DIG?High?Prime?DNA?Labeling?and?Detection?Starter?Kit?II（第二代）是由罗氏公司研发，并且是在DIG?High?Prime?DNA?Labeling?and?Detection?Starter?Kit?I（第一代）的基础上优化升级的，具有更高的准确性、更好的灵敏度、操作时间更短等特点。自1995年地高辛产品上市以来，尽管有定量PCR技术的应用，DIG系统仍然是非放射性高效标记—检测技术的首选，被广泛地应用各种膜杂交及原位杂交技术中。 DIG?High?Prime?DNA?Labeling?and?Detection?Starter?Kit?II 图片 以传代细胞制备生物制品安全性的关键是细胞残余DNA的含量。wHo规程要求,每剂量生物制品中,DNA须低于1 OOPg。目前,国内尚无ver。细胞乙脑疫苗细胞残余DNA测定方法的报道,