qPCR操作步骤..doc

QPCR（Real-time Quantitative PCR Detecting System）即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统→随机引物反转录→反转录产物10倍稀释→real-time PCR. 注意：1 高质量的RNA获取，这里的高质量不是强调RNA降解，而是强调RNA的纯度，不能含有基因组DNA,以及其他杂质污染。基因组DNA的存在会导致定量偏高，给你错误的结果，所以一般用于定量PCR的RNA必须使用DNase处理，消除DNA污染。而RNA中的杂质的污染会限制real-time PCR的反应，导致扩增失败，给你假阴性的结果。RNA的降解不是关键，一个是因为定量PCR的引物扩增目的长度本身很短，150-250个bp，并不用于扩增目标基因的全长。此外是因为存在内参基因，所以RNA降解会通过内参基因的测定来平衡。毕竟一旦发生降解，所有的RNA以同样的速度降解，而相对比率不会改变。2 减少加样误差， 在使用SYBR Green MIX的时候，一定要先按照反应的量（比如8个孔）把所有的试剂一次性配成MIX然后分装，留出5微升的反应体系给模板，使用5微升是因为只有5微升以上，加样枪的误差才会比较小，如果你仅仅是吸取一微升的话，手重一点或者轻一点都会造成极大的加样误差，严重影响你的定量精确度。3 选择合适的内参基因，一般用于定量PCR的内参基因有好几种，但却没有完全通用的内参基因。具体到不同来源的细胞，比如不同组织来源，或者是动物等等，内参基因会有差异，最好的办法是，在你的样品上先测试内参基因，找到变化最小，最稳定的一个。4 合适的引物设计，避免出现引物二聚体，非特异性扩增等。 Q-PCR实验流程： ①实验前准备，每天早上到实验室后，先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。②超净台前做实验，需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需带口罩。③取EP管/枪头时需用镊子，不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后，袋子及时封好。 ④橡胶手套须放入超净台照射紫外，实验操作过程中不得带出超净台，移液器在一天工作结束后调至最大量程，并用75%乙醇清洁移液器，枪头盒及超净台面。⑤实验进行的过程中或观看实验时，没有带口罩不要在超净台前讲话。 二、 总RNA抽提 1)细胞样品用1*PBS洗2次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol (invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min; 组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol 溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称); 加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min; 3) 4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管;(用20-200ul的枪吸取上清，吸上清时，枪头应沿着液面上层吸取上清，枪头不可碰到、吸到中间层) 4)沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)(不应用振荡器混匀)，室温静置10min; 5)4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀(如离心后仍不见EP管底部有沉淀，应将EP管放置在-80度冰箱过夜，继续在4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀)，去上清; 6)用75%乙醇洗涤两次，1ml/次(12,000g离心5min)(加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可，不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀)，超净台风干;沉淀不能过干或过湿，过干则不易溶解，过湿则乙醇残留。 7)视沉淀量加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。 三、去基因组 使用RNase-free的DNase ?(Promega)，按以下体系配置反应液，37℃消化30min，65℃灭活10min。 RNA?DNase ??10 x buffer?H2O(RNase free)RNasin 30201039.50.5 μlμlμlμlμl 总体积 100 μl 然后按以下步骤操作： 1) 加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min，后14,000rpm，离心15min，取上清。 2) 加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm，离心15min，取上清。 3)加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)，-20℃静置15min; 4)4℃下，14,000g离心15min，收集RNA沉淀，去上清; 5)用75%乙醇洗涤两次(12,000g离心5min)，超净台风干; 6)加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。 四、总RNA纯度和完整性