RIP实验技术..doc

【实验技巧】RIP实验技术 RIP实验技术导语 近年来，长非编码RNA（lncRNA）得到了研究界的广泛关注。如今，人们已经鉴定了大量lncRNA，但大多数lncRNA的功能还未明确。为了解决这一问题，研究者们开始对lncRNA的互作蛋白进行研究，并为此开发出了越来越多的分析工具。 下面我们来介绍一下RIP技术。 RNA结合蛋白免疫沉淀技术又称为RIP（RNA immunoprecipitation），可以说是RNA版的ChIP（染色质免疫沉淀），该技术能帮助人们分析与RNA结合蛋白相关的核酸。在RIP试剂盒（如Sigma的Imprint? RNA Immunoprecipitation kit）的帮助下，研究者们能够利用针对RNA结合蛋白的抗体，从细胞提取物中捕获与蛋白相结合的RNA，再通过qPCR、芯片或二代测序技术对这些RNA进行鉴定。 不论是细胞质还是细胞核，都会发生RNA与蛋白的相互作用。据Active Motif公司产品经理Kyle Hondorp介绍，该公司的RNA ChIP-IT? kit专用于研究RNA与细胞核染色质的相互作用。该试剂盒通过甲醛固定来锁定RNA-染色质的互作，随后对染色质进行超声，并用DNAse I处理，最后利用磁珠进行沉淀。 “如你研究的是总mRNA，那么常规RIP试剂盒更合适一些，”Hondorp说，“常规RIP试剂盒可以处理所有细胞裂解物的总mRNA。” 生产Magna RIP? RNA-binding protein immunoprecipitation kit的EMD Millipore公司，也在开发专门针对染色质的RIP试剂盒。预计这一新产品将于2014年第一季度发布，该产品有化学交联与native两种形式。据介绍，化学交联可以分析究间接的蛋白-RNA相互作用，研究更高分子量的蛋白复合物。而native方法展现的是，亲和力更高也更为直接的相互作用。 除RIP以外，CLIP（UV crosslinking and immunoprecipitation）也可以帮助人们捕捉与RNA结合蛋白互作的核酸。CLIP方案整合了交联与核酸酶消化，不仅允许对RNA-蛋白复合物进行进一步的纯化（如凝胶电泳片段分离），还能够揭示RNA-蛋白互作所发生的位点。最近人们又开发出了新型CLIP 技术——iCLIP（individual-nucleotide resolution CLIP），该技术能够以单个碱基的分辨率，来展示RNA-蛋白互作的详细信息。 据伦敦大学学院的Jernej Ule教授介绍，CLIP与RIP的关键性差异，在于沉淀复合物后的凝胶纯化步骤。CLIP技术可以给RNA-蛋白复合物的RNA末端带上放射性标记，并将这些复合物进行SDS分离，之后转移到一张膜上。这样的过程可以提高纯化的特异性，减少非特异性的RNA。蛋白酶消化可以将RNA从膜上解离下来，用于制备cDNA文库，以备测序分析。 “CLIP要比RIP麻烦一些，不过我认为它很值得采用，”Ule说。“放射性信号的量及其特异性，能够帮助我们提高cDNA文库的质量，最终得到准确实用的数据。” 一. 细胞裂解液获取 A. 单层细胞或者贴壁细胞处理 1. 冷PBS清洗培养皿或培养瓶中的细胞两次 2. 加入冷PBS后用细胞刮将细胞刮下来，收集至enpendoff管 3. 1500rpm，4离心5min，弃上清，收集细胞 4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后于冰上静置5min 5. 每管分装200μl细胞裂解液，贮存于-80 B. 悬浮细胞处理：先收集细胞再计数，然后清洗裂解 C. 组织样品处理 1.冷PBS清洗新鲜切下的组织三次 2. 加入冷PBS后，用匀浆器或其他细胞分离设备使组织分散为单个细胞，计数 3. 1500rpm，4离心5min，弃上清，收集细胞 4. 用与细胞等体积的RIP裂解液重悬细胞，吹打均匀后置于冰上静置5min 5. 每管分装200μl细胞裂解液，贮存于-80 二. 磁珠的准备 A. 实验前准备 1、enpendoff管 2、磁力架 3、冰盒， RIP Wash Buffer置于冰上 4、抗体，置于冰上 5、涡旋震荡器6、枪、枪头放于超净台照射30min，枪喷DEPC水 B. 磁珠准备过程 1. 重悬磁珠 2. 标记实验所需的enpendoff管，样品包括目的样品，阴性对照与阳性对照 3. 吸取50μl 重悬后的磁珠悬液于每个enpendoff管 4. 每管加入500μl RIP Wash Buffer，涡旋震荡 5. 将enpendoff管置于磁力架上，并左右转动15°使磁珠吸附成一条直线，去上清，重复一次 6. 用100μl的RIP Wash Buffer重悬磁