RNA干扰及其应用..doc

RNAi是Napoli C D等[1]在试图向紫色矮牵牛花转导色素合成基因,用以增加其花色时发现的。结果出乎预料,转基因的植株不仅没有新基因的表达,反而自身的色素合成也减弱了,一些转基因的花出现了全白色或部分白色。他们把这种导入的基因未表达和植物本身合成色素基因的失活现象命名为共抑制(cosuppression)。之后,Ramano等在向粗糙孢菌(Neurospora crassa)中导入合成胡萝卜素的基因时造成失活,他们称为基因静止(quelling)。Guo S等[2]发现正义RNA与反义RNA有相同水平的抑制效应，但未能就此现象给出合理的解释。Fire A等[3]在研究反义核苷酸时发现在线虫体内,双链RNA( double stranded RNA,dsRNA)能有效地抑制有互补序列的内源性基因,且抑制效果优于单链反义RNA。至此，正式提出了双链RNA诱导的RNAi的概念，开启了RNAi研究的序幕。1 RNAi可能的作用机制及特点1.1 RNAi的作用机制虽然RNAi作用的确切机制尚不清楚，但目前普遍认可是Bass假说。具体概括为三个阶段。（1）起始阶段。在细胞内,双链RNA(dsRNA)由核酸酶(RNaseⅢ) Dicer 在ATP的参与下被处理为21个～23个碱基的小RNA，即小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。siRNA是由19个～21个碱基配对形成的双链,并在其3′末端有两个游离未配对的核苷酸。研究发现, siRNA 是RNAi 作用发生的重要中间分子，序列与所作用的靶mRNA 的序列具有高度同源性；双链的两端各有2个～3个突出的非配对的3′碱基；两条单链末端为5′端磷酸和3′端羟基。这些是细胞赖以区分真正的siRNA和其他双链RNA的结构基础。 研究表明,平末端的siRNA 或失去了5′磷酸基团的siRNA 不具有RNAi 的功能[4]?（2）引发阶段。siRNA与Argonaute蛋白家族及其他未知因素结合，形成siRNA-核蛋白复合物（siRNA-ribonucleoprotein complex，siRNP）。siRNP在ATP及其他未知因素参与下，使双链siRNA解旋形成RNA诱导的沉默复合物(RNA inducing silencing Complex ,RISC)。RISC可能以完全单链或两条链解旋但不完全分离的形式存在，继而RISC在dsRNA的介导作用下与互补mRNA结合，并将其降解。mRNA被降解在转录后水平,抑制基因表达,因而又称之为转录后基因沉默( posttranscriptional gene silencing,PTGS)（3）循环放大阶段。在siRNA诱导的RNAi过程中,可能还存在siRNA 的循环放大过程,以维持它的RNA诱导功能。此过程推测是以siRNA为引物,互补mRNA 为模板,在RNA依赖性RNA合成酶(RNA-dependent RNA Polymerase,RdRP) 的作用下,合成新的双链RNA，再由Dicer作用,产生新的siRNA,完成siRNA 的放大过程，开始新的RNAi循环[5]。关于对RNAi机制中重要酶的作用研究，Zamore P D等[6]发现，21 nt RNA指导mRNA的降解； Scharf W D等[7]发现ATP依赖的RNA解旋酶为Mut6;Grishok A等[8]发现Let-7和lin-4为内源性的RNAi基因（stRNA）；Dalmay T等[9]提出RNA依赖的RNA多聚酶就是SDE-1； Bernstein E等[10]证实RNaseш样的核酸酶为Dicer; Elbashir S M等[11]应用外源性21 nt-siRNA能够抑制同源mRNA的表达;Novina C D等[12]证实无论是针对病毒感染细胞所需的CD4受体，还是针对病毒基因组的gag区域，siRNA都可以有效地使病毒与细胞的基因沉默，抑制HIV的感染与复制。1.2 RNAi的作用特点(1)“共抑制”性。RNAi是双链RNA介导的转录后基因沉默机制,它的启动子相当活跃,外源基因可以转录,但不能正常积累mRNA；RNAi作用不仅使外源基因在转录后水平上失活,同时诱导与其同源的内源基因沉默。(2)高效性。试验证明双链RNA干扰mRNA 翻译的效率比单纯反义或正义RNA 的抑制效率提高了几个数量级；RNAi可在低于反义核酸几个数量级的浓度下,使靶基因表达降到很低水平甚至完全“剔除”,而产生缺失突变体表型。它比基因敲除技术更为便捷,科学家称RNAi技术为靶基因或靶蛋白的“剔降”(knockdown)。(3)高特异性。由dsRNA降解成的小干扰RNA,除其正义链3′端的两个碱基在序列识别中不起主要作用外,其余碱