一定要这样..doc

将上述试剂加入经DEPC处理过的0.2mlEP管中，快速离心混匀，PCR仪中37反应60min，95 5min灭活MMLV，可于4保存2h。Real-time PCR扩增反应 1) 引物设计 引物设计基本原则：引物与模板的序列要紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)，因此需要考虑引物长度、产物长度、Tm、δG、二聚体、发夹结构的能值、GC含量等。设计的引物送上海生物工程有限公司合成具体如。将以上反应体系依次加入0.2ml的EP管中(冰浴上进行)，短暂离心后进行PCR扩增反应。 反应结束后确定Real-TimePCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量作标准曲线。2O 加入 1mlDEPC原液，混匀，15 磅高压 20min，4℃保存备用备用1.5M TrisHCl(pH8.8) 1.3ml ddH2O 1.1ml 10%SDS 50ul 10%过硫酸铵 50ul TEMED 2ul (7) 5%SDS积层胶：(3ml) 配制 30%丙烯酰胺/0.8%亚甲双丙烯酰胺 0.5ml 1.5M TrisHCl(Ph6.8) 0.38ml ddH2O 2.1ml 10%SDS 30ul 10%过硫酸铵 30ul TEMED 3ul (8) 2×SDS样品缓冲液配制：SDS 800mg；DTT 0.616g；甘油 4ml；0.5M TrisHCl(Ph6.8)2ml；溴芬兰少许(0.1%)加蒸馏水至 20ml。混匀，4℃保存。 (9) 1×SDS电泳缓冲液配制：甘胺酸 94g；Tris 碱 15.1g；10%SDS 50ml；用蒸馏水定容至 5000ml，不必调校 PH 值，常温保存备用。 (10) SDS电泳转移缓冲液：Tris 碱 5.8g，甘氨酸 2.9g，SDS 0.37g，甲醇200ml，ddH2O定容至 1000ml，常温保存备用。 (11) 10×TBS：24.2g Tris 碱，80g NaCl，用盐酸调校 pH 至 7.6，去离子水定容至1000ml，常温保存备用。 (12) TBST：1×TBS 1000ml，Tween20 1ml，混匀，常温保存备用。 (13) 5%封闭液：5g 脱脂奶粉，100ml TBST，混匀，常温保存备用。 (14) 甲醛变性胶：0.26g 琼脂糖，17.5mlDEPC水，5.5ml 10×MOPS(3-玛琳代丙磺酸)，5ml甲醛先将琼脂糖溶于DEPC水中，微波炉加热溶解，冷却后加MOPS和甲醛，混合后制板供总RNA电泳。5×甲醛凝胶电泳缓冲液　　　 乙酸钠　　　 EDTA·Na2 5mmol/L 用2mol/L的NaOH或HCl调pH至7.0 (16) 3%过氧化氢溶液：30%H2O2 1份+蒸馏水9份混合而成。 研究 (1) 取冻存细胞，复苏，操作步骤同前。将两种细胞株传代至12孔板，每组细胞传代3复孔，按照前述步骤进行换液，待细胞生长至 85％融合时，弃培养基，PBS 清洗，实验组分别加入终浓度为10 ng/ml的IL-17，以加入等量PBS为对照组，培养24小时。 (2) 细胞总蛋白提取 1) 用加样枪吸净 PBS 后每孔加入200 ul 0.25%胰酶，消化约 5 分钟，每孔加入 1ml PBS，吹打，用吸管将细胞悬液转移至离心管，2000 转/分，10 分钟后弃上清，每管加入 RIPA 250 ul，PMSF 5ul，置于冰上消化 10 分钟。 2) 将所有细胞悬液转移至 1.5mlEP 管中，进行超声裂解细胞。 3) 4℃低温高速离心，12000g，30 分钟。 4) 吸取上清，并做好标记。 5) 蛋白定量：(ＢＣＡ法蛋白定量)准确称取 10mg 的标准蛋白(常用牛血清白蛋白或人血清白蛋白)加蒸馏水溶解，定容到 100ml。取 6 支试管分别编号为 0~5，分别加入标准蛋白溶液 0，20，40，60，80，100ul，并用蒸馏水补足体积到 100ul。各试管加入工作液 2ml，混匀，37℃水浴保温 30min。在分光光度计上，以 0 管为参比，测定各管样品在 562nm 的吸光度值。以蛋白浓度为横座标,