一株产庆大霉素C1a的工程菌及其应用..doc

一株产庆大霉素C1a的工程菌及其应用?WO 2013060073 A1 摘要 提供了一种灭活gntK功能的产庆大霉素C1a的工程菌及其应用，其中，工程菌为绛红色小单孢菌GK1101，已于2011年9月13日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.5245。该工程菌能够用于制备抗菌药物。 权利要求(1) 1. 一株产庆大霉素 Cla工程菌， 其特征在于， 所述工程菌为灭活 功能的絳红色小单孢 飄 Micwmonospom purpurea) GK1101 , 已于 2011年 9月 13日在中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物中心登记保藏， 保藏编号为 CGMCC No. 5245 ο 2. —种如权利要求 1所述的工程菌的发酵方法， 其特征在于， 菌株 GK1101发酵前先用稀释 平板法分离出产孢丰富的单菌落后， 再转接于斜面培养基， 37°C培养 10天， 挖块接种于种子 培养基， 37°C摇床培养 28 h， 转速为 280rpm， 然后按 10%接种量转接于发酵培养基， 37°C摇 床培养 124 h， 转速为 280rpm; 所述种子培养基： 葡萄糖 0.1-1.0%， 玉米淀粉 1.0-2.0%， 玉 米粉 0.5-2.5%， 蛋白胨 0.1-0.8%， 黄豆饼粉 0.5-1.5%， KN03?0.05-0.10% , CaC03?0.1-0.5%, ρΗβ.5-7.5, 发酵培养基： 玉米淀粉 3.0-6.0% , 玉米粉 1.0-2.0% , 蛋白胨 0.1-0.8% , 黄豆饼粉 1.0-4.0 % , KN03?0.01-0.10% , (NH4)2S040.1-0.5% , CaC03?0.1-0.5%, 淀粉酶 0.001-0.025%， ρΗ6·5-7·5。 3. 如权利要求 1所述的工程菌在制备抗菌药物中的应用。 说明 一株产庆大霉素 Cla的工程菌及其应用 技术领域 本发明属于抗生素制药领域， 涉及一种工程菌的构建及其应用， 具体地说， 本发明涉及 一株产庆大霉素 Cla工程菌， 应用于抗生素制造。 背景技术 小单孢菌可产生丰富的次级代谢产物， 特别是氨基糖苷类抗生素， 如庆大霉素、 西索米 星和福提米星等。 这些小单孢菌分布奇特， 生长缓慢且细胞壁结构特殊， 故研究进展缓慢。 此外， 由于缺乏通用的基因操作系统， 小单孢菌遗传操作困难， 使得对其分子生物学的研究 也大大落后于链霉菌。 小单孢菌是庆大霉素产生菌， 庆大霉素是氨基糖苷类抗生素， 已在临床上应用了近半个 世纪， 是我国、 乃至全世界抗感染必备的基本药物。 庆大霉素属多组分代谢产物， 起抗菌作 用的主要组分为 C族复合物： Cl、 C2和 Cla。庆大霉素产生菌代谢产物可开发的组分十分丰 富， 如庆大霉素 Cla是合成抗耐药菌药物依替米星 （Etimicin) 的前体； 庆大霉素 B是进一 步合成抗耐药菌药物异帕米星的母体； 庆大霉素 、 B、 X是进一步开发抗原虫的良好药物； 必威体育精装版研究发现氨基糖苷类抗生素还具有抗 HIV等功效。 因此对该类稀有药用微生物进行深入 研究， 特别是分子遗传学方面的研究， 具有极大意义。 尽管人们对小单孢菌和庆大霉素的研究已近五十年， 也取得了一些可喜的成果， 但一直 未有重大的突破。 青霉素在五十余年的研究开发过程中， 效价提高了近万倍， 而庆大霉素仅 提高了几十倍， 差别非常悬殊。 二十世纪八十年代兴起的链霉菌基因工程， 已在抗生素生物 合成基因的克隆、 产量提高、 组分改善及杂合抗生素生产等方面取得了一定的进展， 但在小 单孢菌中的应用进展缓慢。 依替米星是新型半合成庆大霉素， 是中国独创的抗生素一类新药， 已在多国申请专利， 其知识产权得到了有效保护， 需求量大， 是本类抗生素临床首选药物。 但由于合成依替米星的母体是庆大霉素 Cla (图 1 )。 而庆大霉素 Cla需要从庆大霉素产 生菌的代谢产物中分离才能得到。 不幸的是， 到目前为止， 所有庆大霉素产生菌的代谢产物 是复合物， 主要包括庆大霉素 Cl、 C2和 Cla等。 这些复合物化学结构相近， 理化性质相似， 从中分离单组份庆大霉素 Cla非常困难，导致庆大霉素 Cla供不应求，且生产成本居高不下， 层析分离周期长， 收率低， 料耗大， 污染严重， 提取精制工艺复杂， 而且产品质量不稳定， 与庆大霉素 Cla结构相似的副产物随时出现干扰， 给依替米星产品质量控制造成了极大的不 确定性， 严重影响了药品的稳定性、 安全性和有效性， 是迫切需要解决的科学难题。 若能获得专一性庆大霉素 Cla产生菌， 则以上所有问题将迎刃而解， 其所带来的经济效 益， 社会效益和环境效益等是极其巨大