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生物学综合实验 论文题目 双向电泳 作者姓名 所在院系 生命科学学院 专业名称 生物科学 邵锦震 论文完成时间 201年月日 ’Farrell’s首次建立了等电聚焦（IEF）及SDS-聚丙烯酰胺（SDS）双向电泳技术(2-D)，并成功地分离约1000个E.coli蛋白。该方法依赖于蛋白质的两个重要特性：分子量和等电点。利用这一性质首先通过毛细管聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦技术将不同等电点的蛋白质分开，然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将相同或相近等电点而分子量不同的蛋白质进行相对分子量分离。经过电荷和质量两次分离后,可以得到蛋白质分子的等电点和分子量信息。 第一向IEF/SDS所用的聚丙烯酰胺凝胶通常为柱状，第二向SDS所用的为板状。IEF/SDS与IEF和SDS的区别在于： 1. 第一向的电泳分离系统与相应的单向电泳不同。在进行第一向IEF时，为保证被分离的各种蛋白质能够充分地与SDS结合以利于第二向SDS的进一步分离，必须在第一向电泳系统内加入高浓度的尿素和适量的的非离子去污剂NP-40，而且溶解蛋白质样品的溶液中除了加入这两种试剂外还含有二硫苏糖醇(DTT)。这些试剂本身并不带电荷，不影响各蛋白质原有的电荷量和等电点，其作用在于破坏蛋白质分子内的二硫键，促使蛋白质变性和肽链舒展，从而有利于蛋白质分子在较为温和的条件下与SDS充分结合。 2. 第二向的加样操作与相应的单向电泳不同。经过第一向IEF，蛋白质在第一向的凝胶柱内得到了初步的分离。在进行第二向SDS-PAG时，其加样方式是将第一向电泳后的凝胶柱包埋在第二向的凝胶板内，通常包埋于凝胶板的上端。由于第二向的电泳分离系统不同于第一向，因此必须将第一向电泳后的凝胶柱在包埋于第二向凝胶板之前，预先在第二向的电泳分离系统内进行震荡平衡。所用的平衡液通常与单向SDS-PAG所用的蛋白质样品处理液相一致，内含(-巯基乙醇和SDS等。经过震荡平衡，凝胶柱内原有的第一向分离系统被第二向的电泳分离系统所取代。其中(-巯基乙醇使蛋白质组分分子的二硫键保持还原状态，有利于SDS与蛋白质充分结合，从而完成第二向SDS的样品处理，即可进行第二向电泳。要使聚丙烯酰胺双向电泳能够得到较为精确的分离结果，组成双向电泳的两个单向电泳所依据的分离原理应该有很大的不同。以蛋白质混合组分得分离为例，如果两个单向电泳所依据的分离原理相似，那么所得到的双向聚丙烯酰胺凝胶电泳的分离斑点基本呈对角线分布，这种分离结果并不比单向电泳分离优越。 双向电泳技术是目前蛋白质组学研究中最常用的蛋白质分离技术, 具有相吩简便、快速、高分辨率和重复性等优点。 目 录 1 前言 5 1.1第一向电泳等电聚焦IEF原理………………………………….5 1.2第二向电泳SDS原理…………………………………….6 2 材料与方法 6 2.1 溶液与试剂 7 2.1.1 IEF试剂的配制………………………………………….7 2.1.2 SDS试剂的配制…………………………………8 2.2 实验仪器 12 2.3 实验方法 13 2.3.1 双向电泳整个实验流程………………………………13 2.3.2 第一向电泳等电聚焦IEF15 2.3.3 第二向电泳SDS16 3 结果与分析 19 3.1 影响实验结果的一些因素 19 3.2 催化反应的条件 ……………….20 3.3 注意事项 21 4 参考文献 22 前言。 IEF/SDS双向电泳法是O′Farrall和Klose分别在1975年根据不同组份之间的等电点差异和分子量差异建立的。利用这一性质首先通过毛细管聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦技术将不同等电点的蛋白质分开，然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将相同或相近等电点而分子量不同的蛋白质进行相对分子量分离。经过二维电泳分离的蛋白质在二维电泳图谱所处的位置，就是该蛋白质的相对分子量和等电点。 1.1等电聚焦电泳（IEF，isoelectric focusing electrophoresis） 利用特殊的一种缓冲液（两性电解质）在凝胶（常用聚丙烯酰胺凝胶）内制造一个pH梯度，电泳时每种蛋白质就将迁移到等于其等电点（pI）的pH处（此时此蛋白质不再带有净的正或负电荷），形成一个很窄的区带 pH梯度的组成 pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物，在正极端引入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在负极端引入碱液，如氢氧化钠、氨水等。电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值