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1 PolyA+ mRNA的分离纯化 PolyA+ mRNA的分离纯化采用OligotexTMm RNA试剂盒(Qiagen公司)，首先确定总RNA的数量(OD260×40 μg/mL×稀释倍数×v)在250～500 μg之间，加无RNase的水至总体积为500 μL，然后再加入500 μL的Bufer OBB和30 μL的Oligotex悬液，通过吹打或轻弹使其充分混合。在基因扩增仪上，70℃温浴样品3 min,(此时洗脱缓冲液OEB可一起预热)然后从水浴中将样品取出，室温(20--30℃)放置10 m in。最大转速(140 00g )离心2m in，使Oligotex:mR NA的复合物沉淀，然后仔细的除去上清液。保存上清液直到得到满意的结果。用400 μL的洗涤缓冲液OW2通过涡旋振荡或吹打重悬Oligotex:mRNA沉淀，将重悬的样品加入到Small spin column(置于1.5 mL的离心管上)中，140 00g 离心1m in，然后将small spin column转移到一新的1.5 mL的无RNase的微量离心管中，再加入400 μL的洗涤缓冲液OW2于small spin cloumn,混匀，140 00g 离心1m in。转移small spin column到一新的无RNase的1.5 mL的微量离心管中;取15 μL洗脱缓冲液OEB重悬Oligotex,14 0 00g 离心1m in。将甩下的洗脱缓冲液OEB再重悬Oligotex,最高速离心，然后将甩下的洗脱缓冲液OEB转移至0.5 mL的离心管(无RNase )中，体积约10 μL左右。重复洗脱三次，共计回收4管mRNA，最后几管测吸光值，看是否洗脱干净。 测OD 值 ，取1 μL 样品，加99 μL无RNase的水稀释，将样品从稀到浓进行OD260和OD280的测定，计算出mRNA的量(mRNA的含量1 μg/μL). mRNA在洗脱液中可以贮存在-20 ℃或-70 ℃。1 抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH ) 采用 Clontech公司的Clontech PCR-SelectTM cDNA消减试剂盒进行抑制消减杂交，以 的mRNA (2 μg)为实验方(Tester), 的mRNA (2 μg )为驱动方(driver)，同时进行反向消减杂交。 一、cDNA第一链的合成 按消减试剂盒进行逆转录反应。 ①对每一实验方、驱动方和对照polyA+ RNA（加2 μL the skeletal muscle control poly A+ RNA），在无菌(无RNase)的0.5 mL微量离心管中(不要用聚苯乙烯管)加入下列试剂:a、polyA+ RNA(2 μg)2～4 μL b、cDNA合成引物(10 μM)1μL c、无RNase 水 x μL 总 体积5μL 混匀后在台式离心机上短暂离心。 ②在基因扩增仪(thermal cycler)上70℃ 温浴2min ③立即在冰上冷却2 min，进行短暂离心 ④然后向离心管中加入下列试剂:5×First-Strand Buffer 2μL dNTP Mix (10 mM each) 1μL 无RNase水1μL AMV反转录酶(20 units/μL)1μL 总体积 5μL ⑤涡旋混匀后短暂离心 ⑥充分混匀后培养箱42℃温浴1.5 h(注意:不要用水浴或基因扩增仪) ⑦最后将离心管放在冰上终止cDNA第一链的合成，随后立即进行第二链的合成。 二、cDNA第二链的合成 1、将下列试剂按顺序加入合成第一链的离心管中 RNase 48.4 μL 5×Second-Strand Buffer 16.0 μL dNTP mix (10 mM each) 1.6 μL 20 ×Second-strand enzyme cocktail 4.0 μL 总体积 70 μL 2、加入上述试剂后将其充分混匀并稍微离心，最终体积为80 μL。 3、然后置于16 ℃基因扩增仪上或水浴中温浴反应2h。 4、反应结束后向管内加入2 μL (6 units)的T4DNA聚合酶，充分混匀。 5、16 ℃温浴(水浴或基因扩增仪)30 min。 6、然后加入4 μL的20×EDTA/Glycogen混合物以终止第二链的合成。 7、向离心管中加入100 μL的酚:氯仿:异戊