MALDI-TOF-MS在细菌检测中的应用-1.ppt

制备基质溶液： 常用的基质有图示的4种。 基质种类可能影响质谱峰的形成。 有研究表明，DHB 50 mg/mL， * 50%乙腈，0.1%三氟乙酸为基质，检测液体培养细菌，可获得最佳质谱图。 现已有商品化的配套基质溶液可以购买。 MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用 2.样品的制备 （A）直接挑菌落涂片（75% ～ 90%） （B）乙醇/乙晴处理（10% ～ 20%） 临床标本接种于培养基（液体或固体） 挑取菌落或取液体培养液，经水和乙醇处理 再经70%甲酸/乙腈（1：1）处理 * MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用 3.质谱分析 取一定量样品上清液点加到靶盘上，晾干后再点等量基质（如CHCA等），放干后进行 MALDI-TOF-MS 分析 脉冲激光、模式、加速电压、激光强度等参数还未获得一个统一的模式，需要优化。 * MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用 Ekin=1/2mV2 4.数据分析 通过软件处理质谱图，并进行主成分分析 *横坐标为质荷比（m/z），纵坐标为吸收峰强度 * MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用 * MALDI-TOF-MS在临床微生物中的应用 简要操作流程 * （二）MALDI-TOF-MS在细菌检验中的应用范围 细菌菌种鉴定 多血清型细菌鉴定 耐药性不同的菌株鉴定 真菌的鉴定 血液、尿液及其他无菌液体标本的鉴定 粪便标本的鉴定 MALDI-TOF-MS在细菌检验中的应用范围 1、细菌菌种鉴定 Eigner等应用细菌菌落直接检测上千株代表临床微生物实验室主要分离的细菌，能准确鉴定95.2%。 Seng等研究1066株分离细菌菌株，代表109个不同的种，84.1%能准确鉴定到种，11.3%只能鉴定到属。 Bizzini等分析1371株临床分离株发现93.2%能鉴定到种水平，5.3%到属水平。在鉴定到种的水，MS和传统生化方法平一致率为95.1%。 * MALDI-TOF-MS在细菌检验中的应用范围 1、细菌菌种鉴定 在鉴定非发酵菌方面，用人类感染相关的37个属的248株非发酵菌建立数据库，测定80株临床分离菌，并且和16S rRNA基因序列分析比较。MS能鉴定67株（85.9%），9株鉴定错误，2株不能鉴定。 结论： MALDI-TOF-MS能准确、可重复地鉴定细菌且在10min内，不需要其他的耗材。? 结果错误或不能鉴定是由于MALDI-TOF-MS数据库不完善，大部分的差异是因为系统数据库相关的分类学差异。 * 2、多血清型细菌的鉴定 传统的细菌培养和生化鉴定方法无法对沙门氏菌、大肠埃希氏菌、霍乱弧菌和副溶血性弧菌等多种与人类健康密切相关的多血清型病原菌进行分类，需要进一步采用血清学或噬菌体试验等技术。 应用MALDI-TOF-MS技术对这些多血清型细菌进行鉴定和分类得到了初步应用，在沙门氏菌分型中表现出较好的分型能力。 * MALDI-TOF-MS在细菌检验中的应用范围 3、耐药性不同的菌种 一些研究表明 MALDI-TOF-MS可以快速区分凝固酶阳性和凝固酶阴性的金黄色葡萄球菌 美国范德堡大学和英国曼切斯特大学的研究发现MALDI-TOF-MS可部分替代甲氧西林或头孢西丁纸片法检测耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA） 可以用MALDI-TOF-MS检测针对抗菌剂分子的细菌各种获得性酶，如β-内酰胺酶、甲基化酶、质子泵等。 * MALDI-TOF-MS在细菌检验中的应用范围 4、真菌 MALDI-TOF-MS可用来鉴定酵母菌、酵母样菌、丝状霉菌。Marklein等研究表明，250株临床分离的念珠菌，包含15个种，96%可准确鉴定。 5、血液、尿液及其他无菌液体标本 应用血清分离管或氯化铵溶血标本，MS直接鉴定79%的单一细菌感染。 MS对尿液标本中的细菌快速、准确，尤其是大肠埃希菌，正确鉴定率为97.6%。 也有研究应用MS直接检测和鉴定其他正常无菌液体中的细菌，正确鉴定率为96% 。 * MALDI-TOF-MS在细菌检验中的应用范围 6、粪便标本 直接从粪便选择培养基上生长的可疑菌落进行MALDI-TOF-MS分析，从而对常规引起腹泻的致病菌进行快速鉴别与鉴定。 该方法可提前2 ～ 3d对大多数非乳糖发酵正常菌群，如大肠埃希菌、枸橼酸杆菌、变形杆菌、阴沟肠杆菌、摩根菌等做出准确判定。 * MALDI-TOF-MS在细菌检验中的应用范围 快速检测耐甲氧西林金葡菌 （MRSA） （三）MALDI-TOF-MS 应用举例 * 1.配制基质溶液 最佳基质溶液是50mg/mL DHB + 50%乙腈 + 0.1%三氟乙酸（TFA）。 2.制备样品 所有菌株按照1%的比例接种于5mL LB培养基中,在37