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Western Blotting 样品制备 按照实验设计处理细胞。 收集蛋白： 配细胞裂解液：130μl Laemmli Buffer/（35mm孔）。 标记好带扣的EP管，准备冰盒、细胞刮、烧杯、负压吸引器等。 把细胞板放在斜面冰上操作。彻底吸干培养基（吸2次），每孔加入130μl Laemmli Buffer（含血清的细胞先用4oC预冷的PBS洗2遍）。用细胞刮刮细胞，收集到相应的EP管内（EP管置于专用的冰盒里，但Laemmli Buffer不要放入）。操作时注意不要把冰溅入细胞孔内。 超声（打断基因组DNA，避免样本太粘稠影响上样。） 打开超声：电源→recall 01→enter→start（超声强度37％，0.8s/次）。用双蒸水洗3次探头，擦干。 每个EP管的样本有效超声3次，注意不要让探头碰到管壁。每超声完一管用双蒸水洗3次，擦干后再进行下一管。（注意使样本聚集在EP管底部后超声） 已超声的蛋白应及时做Western Blotting，特别是检测磷酸化蛋白。无特殊情况，测磷酸化蛋白必须当天做Western Blotting，剩余的样本储存于-20oC。 二、SDS－PAGE凝胶电泳 1. 灌胶 ① 提前检查所有的仪器状态。注意电泳液和转膜液是否足量。 ② 检查厚薄玻璃板是否清洁后插到绿色架子上，在桌面上前后左右移动数次，确定两块玻璃板下缘在同一水平面，扣住。 ③ 把绿色架子紧贴灌胶架扣好。 根据目的蛋白的分子量选择分离胶的浓度，按照配方（见附）配置。（10％的过硫酸铵，配后七天内可使用）。 胶混匀后，用5ml枪头灌胶4.2ml（厚玻璃板上标有1.00mm情况），然后用双蒸水慢慢封满。 当分离胶和双蒸水出现明显分界时，准备配集成胶。 倒掉水，用滤纸吸干，注意不接触胶面。 用1ml枪头灌入浓缩胶，灌满为止。插上梳子，避免产生气泡。 2. 等待时 ① 烧开水。 ② 把样本置于圆形的EP管架上（注意水不要没过EP管口）在100 oC加热5mins，然后在冰水里迅速冷却，离心10000rpm,30s，检查各样本量是否一致。 ③ 配电泳液：每个Tank需要300ml电泳液，用5×电泳液加双蒸水稀释，混匀。 3. 加样 ① 从绿架子上取下玻璃板，按标记顺序装在电泳架子里（注意防止漏液）。 ② 注满电泳液，注意内槽的电泳液要没过薄玻璃板，余下加外槽中。然后水平的拔出梳子，拔到中间稍停顿，梳子下方稍向厚玻璃板倾斜，去除梳子和玻璃板之间的胶。 ③ 插上加样器，用专用的加样枪头加样，一般marker 8 μl，自备样品上样量25μl，可根据需要调整上样量。如果上完样本后，两边有多余的泳道，加入Laemmli Buffer防止边缘效应。加样完，样本保存于-20oC，下次使用时再100 oC加热5mins，离心，上样。 电泳 插上电源，注意电极方向。设置恒压200V，时间一般为45mins，可根据需要变化时间长短。观察电流大小：一个Tank双面凝胶电泳时，start120 mA, stop60 mA; 单面凝胶电泳时，start60 mA, stop30 mA。 三、转膜 1. 准备工作： ①标记好PVDF膜（在左上角做标记，如操作日期，胶浓度等），用无水甲醇泡1分钟（激活膜上正电荷以利于和蛋白结合）。 ②把海绵、PVDF膜浸泡在上次回收的转膜液（放于4 oC）里并保持在液面以下（注意回收转膜液瓶中最后一些转膜液不要倒入并丢弃）。 2. 取胶： 电泳结束后，按标记顺序取下玻璃板。用刮板撬开一角，小心取下薄玻璃板。切掉集成胶，并把分离胶切角标记（左上）。然后把胶浸没在转膜液里平衡，每块胶分开放置。 3. 转膜： ① 置放顺序（黑――白）：海绵——滤纸——胶（放置在滤纸上的相对位置与在厚玻璃板上的相对位置一致）——PVDF膜（翻面，且标记处放在右上角）——滤纸——海绵。转膜时手法轻柔，避免压碎胶，注意要在液面以下操作，以免产生气泡。 ② 按照黑对黑(负极)，白对红（正极）的顺序把转膜夹子放在电泳槽里，同时放入冰盒，加满新鲜转膜液（储存于4oC）。 ③ 注意电极的方向。设置恒压100 V，60mins。 观察电流大小：一个Tank转膜电流start250 mA, stop350 mA。 四、封闭 1.配封闭液：5%脱脂牛奶 in TBST（30 ml/2张PVDF膜）。 2.转膜结束后，取出膜用TBST冲洗一遍后，浸没于封闭液，在室温摇床上缓慢摇动，封闭1h。 五、加一抗 1. 一抗稀释液：3%BSA in TBST，调pH 7.4（BSA溶于TBST后，注意调pH 至7.4，以保证抗原抗体反应在适应的pH条件下进行）。 2. 把膜从封闭液里取出，用TBST冲洗一遍后，浸没于一抗里，置于4 oC摇床上缓慢摇动，孵育过夜。磷酸化