westernblot操作步骤之2012版..doc

western blot操作步骤之2012版 Posted on 2012 年 2 月 3 日 by Bob 2011年鄙人做western的时候，发现目前的资料都很老，网上的资料也大多互相传抄，说法各异，于是综合了目前网上所能找到的资 料和个人实际经验，编辑了这份western blot操作步骤2012版，内容包括主要操作步骤和所需要注意的有用的细节，并附上参考文献（原谅我无法像Endnote那样一一注明文献出处，只能大 概标注出引用的参考资料），希望对大家有帮助。鄙人按下文的步骤操作已经做出来了稳定可重复的、背景干净的western条带了，所以相信你也行。为了节 省时间，鄙人总结了一下western blot Quick Guide和一天做出western的具体时间规划，附在文末。初次发这么长的帖子，难免有错，欢迎批判指正。 背景：蛋白质印迹的发明者是斯坦福大学George Stark。Neal Burnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中首次被称为Western Blot。最开始做印迹的是一个叫Southern的科学家，但印迹的对象是DNA链，他把这种技术称为Southern blot，后来出现了两个过程相似，但是对象不同的印迹方法，一个针对RNA，一个对蛋白质，人们分别把这两种技术的称为Northern和 Western，与这两个技术的发明人没有关系了。 一、蛋白质的样品制备: 由于这一步方法各异，具体步骤请参考试剂盒的说明书即可。蛋白质的样品制备是Western Blotting的第一步，样品制备是关键步骤，要求尽可能的获得所有蛋白质，应注意以下问题: 在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。 选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。 防止蛋白质在样品处理过程中的人为的修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（加入合适的蛋白酶抑制剂）。 样品建议分装成合适的量（比如分装出20ul检测蛋白质定量用），然后保存与-20°或-80℃中长期保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。 若蛋白提取过程存在问题或蛋白发生降解则很难进行好之后的实验，也就很难做出好的结果了。除此之外 loading buffer的作用也不容忽视，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，同时在处理时也应注意将样品与loading buffer混合均匀。 二、蛋白质定量 如果要定量的话，一般选择BCA或者Bradford方法，BCA要求检测波长为562nm，Bradford为595nm。具体方法见各试剂盒说 明书。为避免假阳性结果，建议先把lysis buffer加入BCA工作液或考马G250混合看是否产生颜色。测完蛋白含量后，计算含50~100ug蛋白的溶液体积即为上样量（一般8cm宽的迷你 胶每个泳道最大能承载的蛋白质量为150ug，所以如果从组织提取蛋白的话上样量不宜过大）。网上有人喜欢等质量上样（即每个泳道的上样体积不一但质量一 定），也有使用等体积上样（即先把各个样品稀释到某一固定浓度，然后等体积等质量上样，计算上样体积时需包含loading buffer的体积）。按分子克隆的说法，还是使用等体积上样比较好。上样总体积一般不超过15ul，加样孔的最大限度可加20ul样品。上样前要将样品 置于烧杯内，将烧杯置于石棉网上用酒精灯加热至沸腾，在沸水中煮3~5min使蛋白充分变性。也可以使用PCR仪95°加热5min，效果佳，操作方便。 之后样品可以在4°冰箱短时间保存，也可在-20°冰箱保存数月，但是反复冻融会使蛋白质的抗原特性改变。 三、SDS－PAGE电泳 （1）清洗玻璃板： 蘸点洗洁精轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。若不继续使用，需用无水乙醇擦拭后晾干再妥善收起来，玻璃板之间垫玻璃纸隔开。梳子应用水洗干净，临用前用无水乙醇擦拭晾干。 （2）灌胶与上样 1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶（操作前先往玻璃板间灌水，检查是否漏）。 2、按配胶试剂盒说明书选择合适的分离胶浓度配置，最后加入TEMED，之后摇匀即可灌胶。配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试剂的新鲜，特别是过 硫酸铵。灌胶时掌握好速度，避免气泡产生（注意浓度越小的胶含水越多，凝固后胶体积缩小越多）。然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快（灌胶时开始可快一 些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形）。未聚合的丙烯酰胺具有神 经毒性，操作时应该戴手套防护。梳子插入浓缩