Western印迹法..doc

Western印迹法 这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。? 原理：与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达 仪器：高压锅、玻璃匀浆器、高速离心机、分光光度仪、—20℃低温冰箱、垂直板电泳转移装置、恒温水浴摇床、多用脱色摇床。 试剂：单去污剂裂解液、0.01mol/L PBS (pH7.3)、10％分离胶、4％浓缩校、G250考马斯亮蓝溶液、4XSDS上样缓冲液、电泳缓冲液、转移缓冲液、封闭液、PBST、PBS、洗脱抗体缓冲液、显影液、抗体、化学发光试剂。 杂品与耗材：各种规格的吸头、离心管和加样器；各种规格的烧杯、量筒和平皿等玻璃器材；硝酸纤维素膜，乳胶手套，保鲜膜，搪瓷盘（20×20cm），X-光片夹，X-光片，玻棒长短各一根，计时器，吸水纸， 试剂配制： （一）母液 一 SDS电泳 10％SDS SDS 10g 蒸馏水至 100ml 50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。 10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g 超纯水 1.0ml 溶解后，4℃保存，保存时间为1周。 1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris (MW121.14) 45.43g 超纯水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 0.5mol/L Tris·HCl（pH6.8） Tris (MW121.14) 15.14g 超纯水 200ml 溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。 40％Acr/Bic（37.5：1） 丙稀酰胺（Acr） 37.5g 甲叉双丙稀酰胺（Bic） 1g 超纯水至 100ml 37℃下溶解后，4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。 （二）使用液 单去污剂裂解液（50mmol/L Tris·HCl pH8.0，150mmol/L NaCl，1％TritonX－100，100(g/ml PMSF）： 1mol/L Tris·HCl（pH8.0） 2.5ml NaCl 0.438g TritonX－100 0.5ml 蒸馏水至 50ml 混匀后， 4℃保存。使用时，加入PMSF至终浓度为100(g/ml（0.87ml裂解液加入1.74mg/ml PMSF50μl）。 PBS（ pH 7.2-7.4） KH2PO4 0.27g Na2HPO4 1.42g KCl 0.2g NaCl 8g 蒸馏水至 800ml 用浓盐酸调PH至7.5定容至1L PBST : 及含 0.05% -0.5(0.2%)TWEEN-20的PBS 封闭液: 及含 5% 脱脂奶粉的 PBST G250考马斯亮蓝溶液（测蛋白含量专用） 考马斯亮蓝G250： 100mg