真菌DNA大量提取..doc

核裂解法大量提取真菌DNA 一、试剂的配制 EDTA-Na2（0.1 M）：称取3.72 g Na2EDTA·2H2O，用超纯水定容至100 mL。 Tris-HCl（1 M，pH）：称取12.11 g Tris-HCl，用90-95 mL超纯水溶解，调pH至8.0后，在定容至100 mL。 核裂解液(10 mM Tris-HCl,400 mM NaCl，2 mM EDTA-Na2，0.8 mM 盐酸胍)：分别称取76.43 g盐酸胍，23.38 g NaCl于1 L烧杯中，加入灭菌超纯水充分搅拌溶解至900 mL，再加入10 mL 1 M Tris-HCl和20 mL0.1 M EDTA-Na2，搅拌溶解，调pH至8.0，定容至1000 mL，高温灭菌，冷却待用。 SDS（20%）：称取20 g SDS，灭菌超纯水定容至 100 mL。（SDS不能采用高温高压灭菌） 盐酸胍：强烈变性剂，可溶解蛋白质，导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，从核酸上解离下来，此外，RNA酶可被盐酸胍等还原剂灭活。 二、操作步骤 称取液体培养基PPDA培养样品1.0-1.5 g（可用灭菌超纯水或TE缓冲液清洗1-2次），研钵先用液氮预冷，再将样品用液氮研磨，直至全部研磨成均匀粉末。 转入预装5 mL(与样品质量比为1:4-1:6 )核裂解液的15 ml离心管中，加入60 μl 50 mg/mL蛋白酶K（80-150 μl，20 mg/mL），10 μl RNase A充分震荡15s混匀。 加入500 μl 20% SDS（终浓度1%-5%），震荡混匀。 56-65℃水浴，约3 h，至出现较多上清，期间不断颠倒混匀。 冷却后，4℃，6000 rpm，离心10 min，吸取上清至另一新的15 mL离心管中。 加入10 μl β-巯基乙醇（终浓度0.02%），再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇（25:24:1），颠倒混匀30次左右，6000 rpm，离心10 min。（该步骤须在通风厨中进行，颠倒混匀动作轻柔，避免剧烈震荡） 吸取上清至另一新的15 mL离心管，注意不要吸到中间蛋白层。 如果上清十分浑浊，可用等体积氯仿/异戊醇（24:1）再抽提一到两次，同样6000 rpm 离心 10 min，将上清转至新的离心管。（该步骤须在通风厨中进行，颠倒混匀动作轻柔，避免剧烈震荡） 加入等体积-20℃预冷的异丙醇（可先加入1/10体积3 M，pH5.2的NaAc，沉淀效果更好），轻柔颠倒混匀，如果DNA沉淀呈絮团状，可用移液枪枪头或干净玻璃棒将DNA絮状沉淀挑出，若DNA不呈完整絮状沉淀或沉淀较少，可在-20℃ 冰箱放置1-2 h促沉淀。 若DNA沉淀无法直接挑出，可4℃，6000 rpm，10 min收集沉淀，弃尽上清，挑出DNA沉淀。 将DNA沉淀转入2 mL EP管，加入1 mL预冷的70%乙醇，轻弹管壁重悬沉淀。混匀洗涤2-3次，以去除残余的盐，12000 rpm，2 min弃尽上清。 加入1mL预冷的无水乙醇，轻弹管壁重悬沉淀；12000 rpm，离心2 min。（动作轻柔，不可剧烈震荡，避免造成DNA断裂） 室温放置10-15 min左右，使乙醇完全挥发，加入适当体积的灭菌超纯水或TE缓冲液溶解。 CTAB法大量提取真菌基因组DNA 一、试剂的配制 CTAB （十六烷基三甲基溴化铵）提取液（PH 8.0）：2% CTAB（w/v），1.4 M Nacl，0.02 M EDTA，0.1 M Tris-cl，0.2%巯基乙醇。即称取CTAB 2 g加蒸馏水40 ml，加1M Tris-cl（PH8.0）10 ml，0.5 M EDTA（PH 8.0）4 ml和5 M NaCl 28 ml（约8.19 g NaCl），于65℃下溶解，用蒸馏水定容到100 ml，最后pH值8.0，灭菌后加入0.2 ml β-巯基乙醇。 1 M Tris-cl（PH 8.0）：12.11 g Tris碱；ddH2O，80 ml；HCl，4.9 ml三者混匀充分溶解后，滴加浓盐酸调PH至8.0，定容至100 ml。 0.5 M EDTA（PH 8.0）：在80ml水中加入18.01 g EDTANa2·2H2O搅拌溶解，用NaOH调PH至8.0（约2 g NaOH颗粒），定容至100 ml。 5 M NaCl 100ml：称取29.22 g NaCl ，用ddH2O定容到100 ml。 3 M NaAc 10ml：称取2.46 g NaAc，用ddH2O定容到10 ml，pH5.2。 TE溶液： Tris-HCl（pH=8.0，1 mol/ L ）5 ml，EDTA（pH=8.0，0.5 mol/ L）1 ml，加ddH2O定容到500 ml，PH8.0