分子生物学大题..doc

分子生物学大题 一、原核生物和真核生物基因组各自的特点： 原核生物基因组： 1.基因组通常仅由一条环状双链DNA分子组成； 2.结构基因与调控序列以操纵子的形式组织在一起； 3.基因组中重复序列很少； 4.结构基因多为单拷贝； 5.基因是连续的； 6.编码序列一般不会重叠； 7.编码区在基因组中所占的比例远远大于真核基因组而小于病毒基因组； 8.细菌基因组中存在可移动DNA序列。 真核生物基因组： 1.DNA为双链线状且往往不是一条； 2结构基因为.断裂基因，并受一系列顺式作用元件调控； 3.结构基因转录产物为单顺反子； 4.非编码序列远多于编码区； 5.含有大量重复序列和基因家族； 6.DNA末端具有端粒结构； 7.还包括细胞器基因组。 核酸分子杂交技术 1. Southern印迹（检测DNA）首先通过限制性核酸内切酶降解样品中DNA，再经凝胶电泳分离，将分离后的DNA片段从凝胶转移到硝酸纤维素薄膜等上并固定，再用标记过的探针进行杂交，以检测目的DNA。 2.Northern 印迹（检测RNA） 应用DNA探针检测特异mRNA的一种杂交技术，主要用于分析mRNA的转录或mRNA分子大小。其方法类似于Southern印迹杂交。 3.Western 印迹（检测蛋白质） 将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应或“DNA-protein”结合反应鉴别滤膜上的蛋白质。 PCR扩增技术1.基本原理：DNA的半保留复制。 反应体系的基本成分：（1）模板：包括DNA和RNA。 （2）特异性引物：是一段与模板DNA链互补的寡核苷酸片段。（3）热稳定的DNA聚合酶：耐热的Taq DNA聚合酶。（4）dNTP：包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。（5）二价阳离子：常用MgCl，调节DNA聚合酶活性，影响引物退火、PCR的特性。（6）缓冲液：一般使用Tris-Cl，调节pH值，使反应体系偏碱性；（7）一价阳离子：一般为KCl，促进引物退火，高浓度KCl抑制Taq DNA聚合酶活性。 基本操作：（1）变性 将待扩增的模板DNA加热到94℃，使双链DNA解链为单链。 （2）退火 将温度下降至55℃左右，引物与变性的模板DNA利用碱基互补配对结合。（3）延伸 在72℃下，DNA聚合酶在合适的缓冲溶液中，以dNTP为底物，严格按照模板链碱基序列合成互补链，即从引物的3’-OH进行循环，合成方向为5’-3’。以上三步骤为一次循环，每循环一次，DNA分子按指数增加，经多次循环后即可达到大量扩增DNA片段的目的。4.PCR应用： 用于目的基因的直接克隆； 将逆转录与PCR相偶联（RT-PCR），构建cDNA文库；制作DNA探针，进行分子检测等； 用于基因表达与调控研究，如mRNA检测； DNA的多态性分析，如通过限制性片段长度多态性来揭示DNA碱基序列的差异； 临床上进行遗传及传染性疾病的基因诊断； 在制药工业中筛选抗肿瘤的抗生素。四、基因敲除技术 1.基因敲除的一般原理：（1）理论基础：同源重组，发生在两条双链DNA的同源序列之间，涉及的是大片段同源DNA序列的交换。（2）技术基础：胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养技术。2.基因敲除的策略：（1） 基因敲除载体构建特点：具有与ES细胞中目标基因同源的DNA序列；带有选择性标记基因，便于后续的筛选和富集。 （2） 基因敲除载体导入ES细胞基因敲除载体导入ES细胞的方法：显微注射法、电穿孔法、精子载体法、逆转录病毒法等。 （3） 筛选与鉴定基因敲除载体转染ES细胞后，大部分细胞中并没有整合入外源基因，或是发生了随机整合，因此从众多的ES细胞中筛选和鉴定出发生了同源重组的ES细胞是基因敲除的重要步骤。常用的筛选方法有两类：遗传筛选法，包括正负筛选法（PNS法）和正向筛选法；物理筛选法，主要是PCR筛选方法。 （4） 基因敲除动物产生ES细胞经体外遗传修饰之后重新引入动物胚胎，可以发育产生嵌合体或完全ES细胞来源的动物。获得基因敲除纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中，所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。 五、正负筛选法和正向筛选法1.正负筛选法：定义：PNS采用置换型载体，该载体含有正（neo基因，插入载体的同源序列）和负（HSV-tk基因，置于同源序列的外侧）选择基因各一个；同源重组时，载体的同源区发生重组，同源区以外部分将被切除，所以在同源重组时，tk基因将被切除而丢失。而在随机整合时，所有的序列均保留。胸苷激酶蛋白（tk）可使无毒性的更昔洛韦转变为毒性核苷酸而杀