蛋白质生化技术__培训课件.ppt

? 质谱仪分析蛋白质相互作用网络 实验步骤 原核表达并纯化GST融合的已知蛋白。 同时，应用放射性同位素（ 35S）对细胞裂解物进行标记。 将GST融合蛋白与标记好的细胞裂解物混合，同时加入谷胱甘肽偶联球珠，温浴使得融合蛋白的GST能够与球珠结合。 通过离心方法收集GST融合蛋白以及与其结合的可能的蛋白分子 。 在收集到的混合物中加入谷胱甘肽或者直接煮沸，使得目的的混合物能够从球珠上洗脱下来，溶解在SDS上样缓冲液中。 将获得的混合物进行SDS电泳，进行放射自显影或者蛋白染色，进而转膜进行Western blotting 实验鉴定。 还可应用质谱的方法对找到的结合蛋白进行分析，确定未知蛋白的氨基酸组成，从而找到与已知蛋白结合的因子。 Protein Biochemistry Lab Nankai University 应用 确定融合蛋白与未知蛋白间新的相互作用 证实融合蛋白与已知蛋白质间可能的相互作用 Protein Biochemistry Lab Nankai University GST Pull-Down检测蛋白的作用 原核表达的已知蛋白 细胞裂解液中的未知蛋白质 应用cDNA文库，进行体外翻译的蛋白质文库中的未知蛋白 半定量检测蛋白与蛋白的亲和作用 Protein Biochemistry Lab Nankai University GST Protein X GST 35S-labled cell lysate (glutathione-sepharose beads) (glutathione-sepharose beads) 35S-labled cell lysate GST Protein X GST GST Interact at 40C Microfuge to collect complexes Protein Biochemistry Lab Nankai University 实验步骤 1 2 3 autoradiograph Analyze by SDSLane1. Marker Lane2. GST-proteinX Lane3. GST GST GST Protein X Protein Biochemistry Lab Nankai University 实验步骤 prepare protein extract from brain mix and incubate express GST-fusion protein in E.coli pGEX GST gene X Protein Biochemistry Lab Nankai University Protein Biochemistry Lab Nankai University GST-fusion protein GST alone GST pull down验证两种已知蛋白质的相互作用 举 例 input GST Y-GFP + + + X-GST Y-GFP X-GFP + + + GST input 105kD Anti-GFP Anti-GFP Y-GST X-GFP Protein Biochemistry Lab Nankai University 报告基因系统 gene；luciferase；green fluorescent protein 报告基因(report gene)是指一组编码易被检测的蛋白质或酶的基因，将其与目的基因融合表达后，可通过报告基因产物的表达来“报告”目的基因的表达调控。这项技术灵敏度高、检测简便可靠、适于大规模生产，因而在监测细胞信号转导，基因表达和药物筛选等方面得到广泛应用。一般的报告基因需要满足以下几个条件：(1)基因被克隆并且已知全序列；(2)宿主不存在报告基因产物或者不存在类似的内源性物质；(3)表达产物易被检测；(4)报告分子的分析结果应具有很宽的线形围，以便分析启动子活性的幅度变化?；(5)报告基因在细胞或动物内表达对其正常的生理作用或活性没有影响。现主要以目前应用最广泛的报告基因荧光素酶和绿色荧光蛋白为例，综述报告基因的新近应用研究进展。1 荧光素酶(1uciferase，luc) luc是能催化荧光素或者脂肪醛氧化发光的一类酶的总称。根据来源不同主要分为细菌荧光素酶(bacterial luciferase，BL)、萤火虫荧光素酶(firefly luciferase，FL)以及以海星、发光鱼、发光甲虫等为来源的荧光素酶，目前研究最广泛并且成为商品酶的是BL和FL。  报告基因的研究背景 要研究基因的功能，基因的调控机制非常重要，基因的表达产物很复杂并难以准确的定量和定性